MYB转录因子对丹参酚酸类成分生物合成的调控作用及其机制研究

Phenolic acids, a group of major active ingredients in Salvia miltiorrhiza, are biosynthesized via the phenylpropanoid and the tyrosine-derived pathways. MYB transcription factor is an important regulators of the phenylpropanoid pathway. However, the regulation of phenolic acids biosynthesis in S. miltiorrhiza by MYB transcription factor has not been reported. Four genes of MYB transcription factor in S. miltiorrhiza were cloned in our previous work. Significant correlationship between expressions of these genes and contents of phenolic acids was observed. The four genes probably regulated the biosynthesis of phenolic acids in S. miltiorrhiza. To reveal molecular mechanism of phenolic acids biosynthesis regulated by MYB transcription factor, influences of these genes on phenolic acids accumulation will be studied by gene overexpression and RNAi. The target genes of the transcript factor will be investigated by site-directed mutagenesis. Finally, promoters of these genes will be analyzed to screen effective elicitors of phenolic acids as a guidance of S. miltiorrhiza production. This study is very important for us to understand and scale-up the quality of S. miltiorrhiza.

酚酸类成分是丹参药材的主要活性成分之一，主要由苯丙烷和酪氨酸代谢途径合成，MYB转录因子则是苯丙烷代谢途径的重要调控因子。但目前，关于MYB转录因子调控丹酚酸生物合成分子机制的研究还尚未见报道。我们在丹参中克隆得到了4条MYB转录因子全长基因，这些转录因子的表达与丹酚酸的积累具有很强的相关性，它们很可能参与调控了丹酚酸的生物合成。为了进一步阐明MYB转录因子调控丹酚酸生物合成的分子机制，本项目拟通过基因过表达和RNA干扰的方法研究4条MYB转录因子在丹酚酸积累中的作用；采用定点突变技术寻找MYB转录因子靶基因结合位点；最终分析MYB启动子环境信号响应元件，筛选丹酚酸生物合成诱导子，用于指导丹参药材生产。本研究对于揭示丹参药材品质的形成机制和提高丹参品质具有重要意义。

丹酚酸是丹参药材的主要有效成分之一，MYB转录因子是丹酚酸生物合成的重要调控因子。为了揭示MYB转录因子对丹酚酸积累的调控机制，我们利用同源克隆的方法从丹参中获得了4个R2R3 MYB转录因子的核苷酸序列，分别命名为SmMYB39、SmMYB29、SmMYB87和SmMYB36。发现4个目的基因在根、茎、叶和花4个器官中均有表达。SmMYB39在茎中的表达量最高，在花和叶中的表达次之，在根中的表达明显低于其它器官；SmMYB29也是在茎中的表达最高，在花中的表达次之，在根中的表达最低，其在叶中的表达虽然高于根，却明显低于在茎和花中的表达量；SmMYB87除在根中的表达稍低以外，在其他三个器官中的表达量差别不大；SmMYB36在根中的表达最低，在叶和花中的表达量几乎相同。然后，在转化pTF-486空载体的洋葱表皮细胞中，绿色荧光蛋白散布于整个细胞中。在转化pTF-486-SmMYB39和pTF-486-SmMYB29的洋葱表皮细胞中，只在细胞核部位观察到了绿色荧光蛋白的分布。而在转化pTF-486-SmMYB87和pTF-486-SmMYB36的洋葱表皮细胞中，细胞核和细胞膜部位均观察到了绿色荧光。说明SmMYB39和SmMYB29定位于细胞核，而SmMYB87和SmMYB36除定位于细胞核外，还可能定位于细胞膜。进而，构建获得的R2R3 MYB基因的过表达和RNAi沉默表达载体，利用根癌农杆菌介导的植物转化体系获得过表达和RNAi沉默植株，结果发现SmMYB39和SmMYB36的过表达显著（P<0.05）抑制了丹参中酚酸类成分的积累，而RNAi沉默则显著（P<0.05）提高了基因转化株系中酚酸类成分的含量，说明SmMYB39和SmMYB36可以作为负调控因子参与丹参中迷迭香酸等酚酸类成分的生源合成。进一步的研究表明，SmMYB39可以作为转录抑制子调控迷迭香酸生源合成途径上C4H和TAT基因的转录，进而影响C4H和TAT的酶活性。SmMYB36能够与探针MBS1、MBS I和MBS II进行体外互作。本研究为阐明丹酚酸生物合成调控机制提供了参考，为应用基因工程手段改良丹参品质和提高丹参中活性物质的含量提供了理论支持。