源于发酵乳中乳酸菌和丙酸菌亚油酸异构酶错义突变影响酶催化机制的研究

Linoleic acid isomerase(LAI) can catalyze linoleic acid to generate different types of conjugated linoleic acid. CLA processes many biological activities, which widely exists in a variety of foods, but content of CLA was very low. The influence mechanism of LAI catalytic was under research to improve the yield of CLA. Base on the previous research, LAI of Lactic Acid Bacteria and Propionibacterium in fermented milk will be investigated in the present research. The mutant library of LAI will beconstructed by random point mutation and DNA shuffling, and the objective strains are rapidly screened by flow cytometry and label plasmid with fluorescent protein. The difference in expression and enzyme properties of LAI protein was compared by 2D gel electrophoresis. catalytic mechanism of LAI affect by mutations is elucidated by protein metabolism and the expression level of mRNA by using biological chemistry and molecular biology technologies, through homology modeling, isotope-labeled and qRT-PCR. This project will provide a theoretical basis for the mechanisms controlling the regulation of CLA biosynthesis and the key factors of the regulation at the transcriptional level, and lay a theoretical foundation for the increase of CLA yield and application of CLA in fermented products.

亚油酸异构酶能够催化亚油酸（LA）生成不同类型共轭亚油酸（CLA），CLA具有多种生理活性，且广泛存在于多种食物中，但含量较低。为提高CLA的产量，研究错义突变影响酶催化反应的机制。在前期工作基础上，本项目以源于发酵乳中的乳酸菌和丙酸菌的亚油酸异构酶为研究对象，利用随机点突变和DNA改组进行突变，构建突变体库，探索一种流式细胞术与荧光标签质粒联合筛选正突变子的高效、快速筛选方法；通过研究酶蛋白性质和2D电泳比较突变和与突变亚油酸异构酶在性质和蛋白水平上的差异，利用同源建模、同位素示踪突变与未突变菌株酶催化LA转化为CLA的全过程、qRT-PCR分析突变菌株中调控关键因子mRNA的表达水平，揭示突变在分子和代谢水平上影响酶催化底物的反应机制。本项目将为研究突变位点影响酶催化和CLA合成机制及在转录水平调控的关键因子提供理论依据，为提高CLA产量及CLA在发酵食品中应用奠定理论基础。

共轭亚油酸(CLA)是一类由不同位置和几何异构体组成的拥有两个共轭双键的十八碳二烯酸。它广泛存在于多种食物中，亚油酸异构酶(LAI)能够催化亚油酸(LA)生成不同类型共轭亚油酸，CLA具有多种生理活性，但不同类型的CLA生理活性不尽相同。为研究错义突变影响酶催化反应的机制，本研究分离筛选得到来自发酵乳中的乳酸菌25株，其中1株植物乳杆菌具有较好的生产CLA能力，该菌株在37℃、4%接种量、发酵初始pH6.5、发酵时间36h、底物浓度0.5mg/mL、后熟12h时发酵乳滋气味、质构性能和CLA产量最佳；克隆植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌的LAI基因(lai-pl和lai-p)，经测序比对，与相应菌株的基因相似性为100%，且无氨基酸序列的突变。通过生物信息学分析发现lai-pl编码564个氨基酸，预测为亲水性稳定的膜蛋白，lai-p编码424个氨基酸，预测为亲水性不稳定的胞外蛋白。将两种LAI基因在大肠杆菌中表达，lai-pl表达分子蛋白大小约为79kDa，lai-p表达分子蛋白大小约为55kDa。利用定向进化技术突变lai-pl和lai-p，连接绿色荧光蛋白基因gfp，构建2种标签表达载体，结合流式细胞术筛选正突变菌株，在282株乳酸菌源重组菌中，吸光度值提高的菌株有243株，提高率86.2%，其中提高最多的为L155，产量提高了6.02倍；238株丙酸菌源重组菌中，CLA产量提高的菌株有213株，提高率89.6%，其中产量最高的为P229，产量提高了5.11倍。研究突变酶的酶学性质发现：酶的最适反应温度为37℃、温度稳定范围为0~40℃、最适反应pH为7.0、pH稳定范围为pH5.0~9.0之间、最佳底物浓度为0.5mg/mL、金属离子对LAI的活性没有显著影响。乳酸菌源重组菌共有4个氨基酸位点突变，其中69位的酪氨酸突变为半胱氨酸导致38-69位的构型改变，预测69位有可能是有益突变位点。丙酸菌重组菌共有5个氨基酸位点突变，其中138位的谷氨酸突变为精氨酸导致分子间连接力变化，预测可能是酶活改变的主要原因。通过基于UHPLC-Q-TOFMS技术的代谢组研究突变酶代谢差异，认为差异代谢物主要集中在脂质代谢、有机酸及其衍生物代谢、有机氧化合物和杂环化合物代谢途径，可能参与LAI催化代谢调控。