乳酸菌木糖代谢关键酶的调控对乳酸发酵影响的研究

For relief of food crisis and diversification of lactic acid fermentation materials, it is necessary to improve the efficiency on utilization of xylose which is the precursor to hemicellulose, the second most monosaccharide composition in plant matter. In order to study on the influence of lactic acid fermentation by regulation of key enzymes in xylose metabolism, Lactobacillus delbrueckii and Lactococcus lactis are selected for research and screen the fermentation intermediates, FBP, 3-PGA, PEP and pyruvate by NMR in this work. Regulation of key enzymes: (I) Knockout L. lactis xylose transporter XylT and expression of xylose and arabinose ATP binding cassette transporter and symporter in L. lactis and L. delbrueckii; (II) Introduction of the enzymes into L. delbrueckii, including the enzymes conversing xylose to xylulose-5P, transketolase and transaldolase; (III) Expression of PFK, PK and LDH in L. lactis and L. delbrueckii; (IV) Investigation of the inhibit effect of byproducts by knockout the phosphoketolase (XPK) and pyruvate oxidase (POX). And investigate the plasmid stability under the selective pressure of xylose utilization. This work will lay the foundation of improvement of the lactic acid productivity using xylose, and provide a possible approach for the genetic modification of lactic acid bacteria.

为帮助缓解粮食危机，使乳酸生产原料多元化，充分利用纤维原料中的第二单糖成分-木糖，本课题将以乳酸菌为发酵菌株，分析木糖代谢途径中各关键酶对乳酸发酵的影响，同时用NMR技术监测代谢中间产物FBP、3-PGA、PEP和丙酮酸等的变化，建立木糖发酵乳酸的代谢调控系统。各关键酶分析：敲除乳酸乳球菌的木糖协同转运蛋白XylT，在乳酸乳球菌和德氏乳杆菌中分别表达木糖和阿拉伯糖的ATP结合盒转运蛋白和协同转运蛋白，调查糖转运蛋白对木糖代谢的影响；调查木糖代谢缺失酶-木糖转化至5-磷酸木酮糖途径酶、转酮醇酶和转酮醛酶在德氏乳杆菌中的表达对木糖代谢影响；调查乳酸乳球菌和德氏乳杆菌PFK、PK和LDH的表达对木糖发酵乳酸的影响；调查通过敲除XPK和POX对副产物的抑制影响。并且考查木糖利用的选择压力对质粒稳定性的影响。此研究将为木糖发酵乳酸产速率的提高奠定理论基础，为乳酸菌的基因改造提供理论依据。

为帮助缓解粮食危机，使乳酸生产原料多元化，充分利用纤维原料中的第二单糖成分-木糖，本课题以乳酸菌为发酵菌株，分析木糖代谢途径中各关键酶对乳酸发酵的影响。研究内容：敲除乳酸乳球菌的木糖协同转运蛋白XylT，在乳酸乳球菌和德氏乳杆菌中分别表达木糖和阿拉伯糖的ATP结合盒转运蛋白和协同转运蛋白，调查糖转运蛋白对木糖代谢的影响；调查木糖代谢缺失酶-木糖转化至5-磷酸木酮糖途径酶、转酮醇酶和转酮醛酶在德氏乳杆菌中的表达对木糖代谢影响；调查乳酸乳球菌和德氏乳杆菌PFK、PK和LDH的表达对木糖发酵乳酸的影响；调查通过敲除XPK和POX对副产物的抑制影响。并且考查木糖利用的选择压力对质粒稳定性的影响。重要结果：1、表达木糖协同转运蛋白XylE提高了乳酸乳球菌木糖发酵产乳酸效率，在36h时乳酸产量提高了17%，最终48h提高了7%，木糖多消耗了19.4%；在携带糖转运蛋白的乳酸乳球菌发酵木糖产乳酸的实验中，发现糖转运蛋白有促进作用，效果依次为XylE > XylFGH > AraE ≈ AraFGH。2、携带XI途径木酮糖激酶、转酮醇酶、转酮醛酶、木糖异构酶的乳酸乳球菌相较于野生型，在36h时乳酸产量提高了17%，最终48h提高了8.6%，木糖多消耗了9.6%。XI途径酶对产乳酸的效率有促进作用。3、乳酸乳球菌中分别过表达PFK、PK和LDH基因的木糖产乳酸的实验中，因为乳酸乳球菌自身携带这3个基因，结果显示对木糖消耗和发酵乳酸产量无明显影响。4、因为整个研究内容中，基因敲除和基因敲入的不顺利，建立木糖转运蛋白、木糖代谢缺失酶、PFK、PK和LDH对乳酸菌木糖利用的调控系统的目标暂时没有成功。