特异性4-1BBL+B7-1+T细胞过继免疫治疗人脑胶质瘤的实验研究

脑胶质瘤发病率高，传统措施疗效差，免疫治疗是理想的新方法，但我们前期研究发现NDV瘤苗及CIK细胞过继免疫治疗效果有限，如何增强T细胞的抗肿瘤作用是免疫治疗成功的关键。4-1BBL和B7是T细胞活化的重要共刺激分子，4-1BBL在T细胞免疫应答中具有强大的放大效应，而B7表达是T细胞活化的必要条件，但我们进一步实验发现胶质瘤细胞不表达B7-1。本课题旨在人为提供B7-1共刺激信号诱导肿瘤特异性T细胞活化，用4-1BBL信号增强T细胞的增殖和效应。拟将人4-1BBL基因和B7-1基因转染入T细胞，制备4-1BBL+B7-1+ T细胞；然后与胶质瘤细胞共培养，无需其他APC存在的条件下刺激T细胞活化并扩增胶质瘤特异性T细胞；最后通过体内外实验观察4-1BBL+B7-1+ T细胞对胶质瘤的治疗作用。本研究为制备大量高效的胶质瘤特异性T细胞提供新方法，籍此提高胶质瘤过继免疫治疗的疗效。

目的 建立4-1BBL+B7-1+T细胞扩增系统，增强其特异性T细胞的杀瘤活性。对荷瘤的胶质瘤小鼠进行过继免疫治疗，籍此提高胶质瘤免疫治疗的疗效。同时对4-1BBL和B7-H4等分子在人脑胶质瘤中的表达进行研究。方法 构建表达人4-1BBL基因的重组逆转录病毒载体，并和B7-1基因的逆转录病毒载体共转染人T细胞，制备4-1BBL+B7-1+T细胞。通过免疫磁珠分离获得CD3+T细胞，将其按1:1 的比例加入已贴壁生长的胶质瘤细胞株T98G和自体瘤原代培养的单层细胞中，体外诱导胶质瘤特异性T细胞活化与扩增。以培养中第14、18、24天的T细胞作为效应细胞，T98G胶质瘤细胞株或自体瘤细胞为靶细胞，用4小时51Cr释放实验检测其杀伤活性，用ELISA双抗夹心法检测IFN-γ的分泌量。将4-1BBL+B7-1+ T细胞过继转移给荷瘤的SCID鼠，从整体水平观察4-1BBL+B7-1+T细胞对已形成的胶质瘤的治疗作用。并且使用免疫组化方法对4-1BBL和B7-H4等分子在人脑胶质瘤中的表达进行检测。结果 成功构建了重组4-1BBL基因的逆转录病毒载体，与实验室已构建的B7-1基因的逆转录病毒载体共转染人T细胞。FACS结果显示共转染细胞的4-1BBL基因和B7-1基因明显上升。经FACS证明其为效应T 细胞。发现4-1BBL+B7-1+T细胞作为效应细胞，T98G胶质瘤细胞株或自体瘤细胞为靶细胞时，18天培养，靶比值为100：1时，杀伤活性最佳。已成功构建荷胶质瘤 SCID 鼠模型。人胶质瘤的研究发现4-1BBL 和B7-H4在年轻胶质瘤患者表达率较高。结论 本研究为制备大量高效的胶质瘤特异性T细胞提供了新方法。4-1BBL和B7-1基因共转染的T细胞，经胶质瘤细胞株或自体瘤原代培养细胞体外诱导其活化与扩增，能有效杀伤对应的胶质瘤靶细胞。4-1BBL和B7-H4在判断胶质瘤患者的预后方面有参考价值。