2型Na-K-2Cl共转运体在结肠上皮的定位以及对离子转运功能的调控研究

2型Na-K-2Cl共转运体(NKCC2)在肾脏大量表达，主要功能是介导Na+-K+ (NH4+)-Cl-的重吸收。申请者前期工作首次证明NKCC2在哺乳动物胃肠道有表达且在结肠粘膜上皮细胞顶侧膜的免疫阳性明显高于基侧膜。已知远端结肠具有重吸收NaCl和水、分泌K+和HCO3-的作用，但NKCC2是否参与和介导这个过程、NKCC2在结肠上皮的亚细胞定位及膜转位调节均未见报道。本课题拟采用分子生物学技术、免疫组织化学和Confocal等方法观察NKCC2在结肠上皮细胞的表达与定位；采用短路电流记录技术并结合基因干扰等方法研究NKCC2对结肠上皮离子转运的影响；最后通过观察抗利尿激素对NKCC2的亚细胞定位、膜转位及跨膜离子转运的调节，确定NKCC2是否作为抗利尿激素的靶点之一参与调节结肠上皮离子转运的功能。该研究可为肠上皮离子转运的生理机制及临床结直肠功能紊乱的诊治提供一定的理论与实验依据。

2型Na-K-2Cl共转运体属于吸收型转运体，主要在肾脏表达，特别是在髓袢升支粗段及致密斑的上皮细胞顶侧膜，主要功能是介导Na+-K+ (NH4+)-Cl-的重吸收。现有关于NKCC2的研究大都局限在肾脏，课题申请人之前的研究表明成年大鼠胃、空肠和远端结肠上皮细胞以及黏膜下和肌间神经丛部位都有NKCC2的mRNA和蛋白表达。然而关于NKCC2在大鼠，小鼠和人的结肠上皮准确定位却不清楚，及它的功能和调控机制仍不清楚。为此本项目主要目的是：① 进一步明确NKCC2在其他种属如小鼠及人结肠上皮的表达和定位。② 利用短路电流技术结合离子替换和阻断剂等方法检测NKCC2是否参与结肠上皮Cl-的吸收。③ 观察抗利尿激素对结肠上皮NKCC2的膜转位及离子转运调控。④ 使用基因干扰技术敲减NKCC2的表达，观察结肠上皮离子转运功能改变。主要结果如下：在大鼠末段结肠黏膜顶端膜表达的NKCC2参与介导forskolin刺激后引起的短路电流。离子替换和阻断剂等方法鉴定了这一过程有Cl-吸收和HCO3-分泌参与，顶膜表达的NKCC2介导腔面膜的Cl-吸收。在小鼠结肠免疫荧光结果显示在结肠上皮下部隐窝部位有NKCC1高表达，在隐窝区域NKCC1主要定位于基侧膜，与之前研究相似。与此相比，NKCC2主要位于结肠表面上皮的顶端膜。使用dDAVP（V2受体激动剂10ng/每只动物，腹腔注射）在结肠检测其对NKCC2胞内转运的效应。在刺激30分钟后，在表面肠上皮细胞的顶端膜可见较多的NKCC2荧光染色。更明显的是经1小时刺激后，抗利尿激素引起的NKCC2的膜聚集较30分钟更显著。光密度值观察显示：NKCC2荧光密度相较于未刺激肠上皮分别为1.5和3倍。Western的结果也证实了这一结果。未刺激情况下，NKCC1主要标记在隐窝上皮细胞的基膜和侧膜，在结肠隐窝也有部分存在于细胞内。经过30分钟和1小时刺激后在基侧膜表达的NKCC1分布和表达并未出现明显的变化，说明抗利尿激素主要影响NKCC2而非NKCC1。短路电流结果表明顶膜侧表达的NKCC2可以被抗利尿激素激活并参与它引起的反应。另外，基因干扰技术进一步证实NKCC2的表达和部分说明了在结肠离子转运中的功能。