利用报告基因和CRISPR技术对人类胚胎干细胞进行神经分化基因筛选的研究

Degenerative diseases bring great misfortune to patients and their families, and there is no effective method to cure. Human embryonic stem cells (hESCs) are valuable cell resources in cell replacing therapies research for holding multiple differentiation potentials to three germ layers. However, the mechanism underlying neural differentiation of hESCs is not clarified clearly yet, resulting in the low efficiency. It is important to find a efficient and strict strategy to uncover the regulation mechanism of neural differentiation. The discovery of key genes and pathway could improve efficiency and help to obtain more neural lineage cells, which would push forward the research of cell-replacement therapies. This project will mark hESCs with neural stem cells specific marker genes by genomic editing technology, and screen the vital differentiation genes in these reporter hESCs via CRISPR system and whole-scale guide RNA library, figuring out essential mechanism behind neural differentiation.

神经类退行性疾病给患者及其亲属带来了巨大的不幸，目前尚未有可行的治愈方案。人类胚胎干细胞因为具有多胚层的分化潜能而成为细胞替代治疗研究的珍贵资源细胞。但目前对人胚胎干细胞进行神经分化的机制尚未完全解析，从而导致分化效率极低，因此需要寻求一个高效和严谨的策略对神经分化的调控机制进行进一步的研究探索。找到调控神经分化的关键基因和网络，对于提高神经分化效率，获取大量可用于细胞替代治疗细胞的具有巨大的推动作用和实用价值。本研究拟通过基因编辑技术在人胚胎干细胞上标记神经干细胞报告基因，然后借助全基因组的向导RNA库和CRISPR技术对人胚胎干细胞进行遗传学筛选，最终获得调控神经分化的关键基因列表，解析神经分化的关键机制。

本研究通过基因编辑技术在小鼠胚胎干细胞上标记神经干细胞报告基因（Pax6-GFP），能够在体外快速高效地获得神经干细胞。借助此策略，申请人结合优化后的流式分选技术，获得了小鼠单倍体神经干细胞。基于单倍体的纯合子特色，申请人还进行了多种遗传学筛选研究，找到了若干生物学过程中的关键基因，这些研究对我们进一步构建携带神经干细胞报告基因的人类胚胎干细胞，并利用其进行神经谱系遗传学筛选研究具有指导意义。目前取得的成果如下：1.利用Pax6-GFP报告系统在体外分化的过程中结合流式分选技术成功建立小鼠单倍体神经干细胞；2.利用piggyBac转座系统对猕猴单倍体神经祖细胞进行高通量遗传学筛选，成功获悉河豚毒素类似物的靶点基因B4GALT6；3.利用所建立的小鼠单倍体滋养层干细胞进行遗传学筛选，得到阻碍海绵滋养层细胞特化的关键基因。