利用CRISPR/CAS9技术在水稻染色体上实现报告基因定点整合进行种质创新的探索研究

The development of hybrid rice has been the most important application for increasing rice production. The hybrid seeds from the three-line hybrid system and the two-line hybrid system lead to tremendous increases in yield. However, two generations of hybrid seed production technology have obvious shortcomings. Therefore, the development of new hybrid seed production systems for future rice production practice is being actively pursued. The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) system, has been used widely for genetic engineering, including in gene knockout, gene knock-in and various chromosomal rearrangements. In this project, using the CRISPR/CAS9 system, gene cassettes of marker gene DsRed will be inserted to target locations in the rice genome and combined with a wild-type fertility gene locus enabling pollen production. Then, the hybridization of the obtained transgenic rice with the male sterile mutant will produce maintainer, which can be applied to the production of male sterile seeds. We anticipate that this new hybrid seed production system may lead to a new era of hybrid rice practice.

杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。三系法和两系法水稻杂交育种技术对粮食增产贡献巨大，但“三系法”受恢保关系限制对种质资源利用率低以及“两系法”受环境条件影响存在杂交制种安全。水稻普通隐性雄性核不育材料育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合，但无法实现不育系种子的批量繁殖。CRISPR/CAS9是最新的基因组编辑技术，已被广泛用于基因组的定点突变、定点置换和定点整合。本课题利用CRISPR/CAS9系统的功能，将筛选报告基因(DsRed)表达元件在水稻染色体上定点整合，实现筛选报告基因与育性调控基因的紧密连锁，将获得的转基因材料与雄性不育突变株杂交获得保持系，保持系与雄性不育突变株杂交可用于不育系种子的繁殖。我们希望这个新的育种技术可以为水稻普通隐性雄性核不育材料的繁殖和应用提供技术支持, 为杂交水稻的发展揭开新的篇章。

杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。三系法和两系法水稻杂交育种技术对粮食增产贡献巨大，但“三系法”受恢保关系限制对种质资源利用率低以及“两系法”受环境条件影响存在杂交制种安全。水稻普通隐性雄性核不育材料育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合，但无法实现不育系种子的批量繁殖。本研究内容是利用CRISPR/Cas9技术实现外源基因片段在水稻染色体上的定点插入整合，实现荧光报告基因和育性调控基因的紧密连锁和共分离，以解决水稻隐性雄性核不育材料的繁殖和应用问题。我们最先尝试供体片段和Cas9表达盒共转化的方法，即将CAS9 序列和插入靶位点序列连接到潮霉素基因所在 T-DNA区，将红色荧光蛋白基因表达元件连接到另一 T-DNA 区（供体序列）。供体片段不含插入位点同源序列。虽然获得了转基因植株，但是通过分析并没有发生整合事件。随后，分别构建含靶位点同源序列的供体载体和打靶载体，遗传转化采用三种方法：第一种方法为共转化，把供体载体和打靶载体以合适比例混合，进行农杆菌侵染；第二种方法为分步转化，供体载体和打靶载体含不同的筛选标记基因，先通过侵染把供体片段整合到水稻基因组上，然后再通过侵染把打靶载体整合到基因组上，利用Cas9蛋白的编辑能力实现供体片段游离和定点整合。第三种方法为分别转化，分别获得供体载体和打靶载体的转化植株，然后通过常规杂交实现两个载体的聚合，进而实现外源片段的移动和整合。对获得的转基因植株进行分析，发现整合位点发生了定点编辑，但是并没有实现外源片段的整合。我们推测可能是我们获得的转基因植株还太少，另一个就是整合效率太低。在植物中，外源片段的定点整合问题如果解决，必将给作物育种定向改良带来深远的影响。