利用CRISPR/Cas基因编辑技术对于重症B型血友病进行基因修复和治疗的小鼠模型研究

Mutations in the coagulation factor genes will cause the genetic bleeding disorder—haemophilia. Our country holds about 100,000 haemophilia patients which is one-fourth of the world’s haemophilia population. Current main treatment of the disease is the replacement therapy which can alleviate the symptom for a while but cannot eradicate the disease. The efficacy of the treatment is always compromised when patients develop antibodies to the exogenous factors. On the other hand a phase II clinic study of gene therapy successfully achieved long term in vivo expression of normal IX factor by delivery of the F9 CDS via the adenovirus-associated virus (AAV). However the ideal treatment of correcting the mutations in situ via gene editing technology was never reported. The advantage of in situ gene correction is that it brings the minimal risk of random gene insertion. In order to achieve our goal, we have generated several haemophilia B mouse models carrying point mutations on the f9 gene. Our strategy is to combine the advantage of the powerful CRISPR/Cas tools and the efficient AAV delivery system to fix the point mutations in the mouse model. Further more, we will attempt to increase the homologous recombinant via over expression the AAVR and tail vein injection of the compound SRC7.

血友病是由于表达凝血因子的基因发生突变所导致的。我国现有血友病患者10多万名，占世界的4分之一。血友病现有的疗法是凝血因子替代疗法，该方法昂贵、无法根治该疾病且疗效可能因为产生抗体而下降。最新的B型血友病基因治疗临床II期研究是通过腺相关病毒（AAV）将凝血因子基因递送至患者体内从而达到持久的疗效。但是通过原位修复基因突变治疗血友病这一最理想的治疗方法还未有报道。申请者为了研究血友病的基因治疗已构建了多种重症B型血友病小鼠模型。我们计划利用最新的CRISPR/Cas基因编辑技术结合腺相关病毒递送技术，在小鼠f9基因突变位点进行原位修复或者在f9基因启动子后插入野生型f9编码序列已达到治疗血友病小鼠的目的。这种方法的优势在于基因修复后的f9因子的表达调控与野生型类似所以潜在的风险最小。另外申请者拟利用过表达腺相关病毒受体AAVR或者尾静脉注射化合物SRC7等的手段来提高基因修复效率。

CRISPR/Cas9 系统的横空出世以其灵活性与便利性为基因编辑带来了颠覆性力量。CRISPR/Cas9 系统来源于细菌或古细菌的适应性免疫系统。在这些细菌的基因组中，存在一群成簇分布的有规律间隔的短回纹序列。当噬菌体感染细菌后，这些序列能够 进一步被转录剪切成为引导 RNA。引导 RNA 能 够与 Cas9 形成复合物，通过 Waston-Crick 配对引 导 DNA 内切酶 Cas9 靶向噬菌体的基因组DNA将 其切断，从而抵御噬菌体的入侵。在科研人员的 努力下，CRISPR/Cas9 系统已被单独克隆并改进，现在只需要设计相应的引导RNA(sgRNA)就能够靶向任意 DNA 序列。更令人惊喜的是，Cas9 蛋白也是一种很好地锚定蛋白，能够在保持自身活性的情况下与其他 功能蛋白融合表达，由此进一步诞生了一大批衍生型基因编辑工具，能够进行DNA表观修饰、提高重组效率、单碱基编辑等等。由于CRISPR/Cas9 高效、精准、灵活的特点使其在很多疾病模型的研究中取得了成功，同时也使基因编辑领域 得到了前所未有的关注。.B型血友病是一种X染色体连锁的凝血障碍疾病，主要症状表现为异常出血。B型血友病是由于凝血因子9的缺乏或者功能障碍引起的，在全球大约每5000个男性中就有1个患此病。本研究借助CRISPR/Cas9基因编辑工具，以腺相关病毒为主要递送在体对小鼠、大鼠两种不同的重症血友病模型进行了基因治疗。并成功通过非同源重组依赖的定点整合将重症B型血友病大鼠模型的aPTT指标恢复到了正常大鼠的范围。