靶向病毒核蛋白的新喹啉酮生物碱衍生物抗甲型流感病毒作用机制研究

The nucleoprotein (NP) of influenza A virus (IAV) plays an important role in the process of viral vRNP assembly, transportation and RNA replication. Thus, the NP targeting compounds are expected to be developed into novel anti-IAV agents. Our preliminary studies indicated that the novel quinolone alkaloid compound QLA derived from marine fungus possessed significant anti-IAV effects in vitro and in vivo, and it may inhibit IAV infection and replication by targeting viral NP protein. On that basis, the project intends to identify the IAV infection stages which QLA affects by using immunofluorescence, RT-PCR and western blot, so as to reveal the virus replication events which QLA inhibits; To explore the influence of QLA on NP oligomerization and RNA binding by performing immunoprecipitation, SPR and electrophoretic mobility shift assay; To investigate the inhibition mechanism of QLA against RNP nuclear export by using immunofluorescence and Pull-down assay; To further explore the binding sites of QLA on NP protein by using SPR, molecular docking, and resistant strain screening methods, so as to reveal the interaction model between QLA and NP protein. In summary, the implementation of this project will not only provide the theoretical reference for the development of novel anti-IAV drugs derived from marine fungus, but also provide a reference for the anti-IAV therapy targeting virus NP protein.

甲型流感病毒（IAV）的核蛋白（NP）在病毒vRNP组装、转运及RNA复制等过程中发挥着重要作用，因而靶向NP的化合物有望研发成为新型的IAV抑制剂。项目组前期研究发现海洋真菌来源的喹啉酮生物碱衍生物QLA具有显著的体内外抗IAV作用，且其可能是通过靶向NP蛋白来抑制IAV的感染和复制过程。本项目拟首先利用免疫荧光，RT-PCR和western blot等对QLA作用的IAV侵染阶段进行研究，以揭示其作用的病毒复制事件；利用免疫沉淀，SPR和凝胶迁移阻滞实验等探究QLA对NP寡聚化及RNA结合的影响；利用免疫荧光和Pull-down assay等探究QLA对RNP出核的抑制作用机制；利用SPR、分子对接和耐药株筛选等方法探究QLA作用的NP蛋白位点，以揭示QLA与NP的相互作用模式。本项目的成功实施不仅为新型抗IAV海洋药物的研发提供理论参考，还将为靶向NP蛋白的抗IAV治疗提供借鉴。

甲型流感病毒（IAV）的核蛋白（NP）在病毒vRNP组装、转运及RNA复制等过程中发挥着重要作用，因而靶向NP的化合物有望研发成为新型的IAV抑制剂。项目组前期研究发现海洋真菌来源的喹啉酮生物碱衍生物QLA具有显著的体内外抗IAV作用，且其可能是通过靶向NP来抑制IAV的感染和复制过程。在此基础上，本项目进一步研究发现QLA具有很好的体外抗IAV作用，对H1N1和H3N2亚型都具有很好的抑制作用。QLA主要抑制病毒吸附后的早期感染阶段，但不抑制病毒膜融合。QLA显著抑制病毒vRNA复制和mRNA转录，且还能抑制NP的出核转运，表明QLA主要靶向NP蛋白。FISH和荧光定位研究表明QLA能够抑制病毒vRNA出核而非mRNA出核，且主要干扰NES3通过CRM1途径的出核转运。QLA能够特异性地结合NP蛋白，且干扰NP与CRM1的相互作用。Pulldown实验和凝胶迁移阻滞实验表明QLA能抑制NP与RNA的结合而非NP的寡聚化进而影响vRNP组装。分子对接结合耐药株筛选和反向遗传学研究发现QLA主要作用于NP的Arg305和Gly490，且这些氨基酸周围的结合口袋可作为NP靶向的抗IAV药物的潜在靶点。此外，QLA口服给药能显著降低肺病毒滴度，提高小鼠生存率，减轻体重下降趋势，抑制肺部炎症，优于奥司他韦。因此，QLA具有很好的体内外抗IAV作用，且其主要通过靶向结合NP来抑制IAV的感染和复制。总之，本项目的研究成果不仅为新型抗IAV海洋药物的研发提供物质基础和理论参考，还可为靶向病毒NP蛋白的抗IAV治疗提供借鉴。