三七素生物合成关键酶基因克隆与功能分析

Dencinchine (β-ODAP) is an important active component with emostatic function in medical plant Panax notoginseng. Studying on the dencinchine biosynthesis will help us understanding the quality of P. notoginseng. Previous studys had shown that, BIA（β-(isoxazolin-5-on-2-yl)-L-alanine is the direct precursor of β-ODAP and comes from L-serine catalyzed by serine O-acetyltransferase (SAT) and BIA synthase (BIAS); then BIA cztalyed by another unkonwn enzyme and 2,3-diaminopropionate N-oxalyltransferase for the formation of β-ODAP. The last step reaction alse need oxalyl-CoA, which comes from acetate and catalyzed by oxalyl-CoA synthetase. Until now, the pathway of dencinchine biosynthesis and the involved enzmes and genes are still absolutely unkown. For elucidate the biosynthesis pathway of dencinchine in P. notoginseng, three keys enzyme (OCS, SAT and BIAS) genes will be cloned, their catalytic characteristics of the enzymes and the functions of their genes will be detected by heterologous expression in yeast expression system and knockouted using Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation, respectively. Furthermore, the temporal and spatial expression of genes and the effects of environment factors on their expression will be detected by Real-time PCR. The results of this study will provide a full understanding of biosynthesis of dencinchine and helpful information on the quality of P. notoginseng.

三七素（β-ODAP）是一种非蛋白氨基酸，是三七重要的止血功能成分。研究三七素的生物合成有助于加深我们对三七品质形成机理的理解。BIA是β-ODAP生物合成的直接前体，而BIA则是由丝氨酸O-乙酰转移酶（SAT）和BIA合酶 （BIAS）催化L-丝氨酸而形成的；然后由一种未知酶的催化BIA合成DAPA（2,3-二氨基丙酸），最后由DAPA N-草酰转移酶催化DAPA和草酰-CoA而形成β-ODAP；而草酰-CoA则是由草酰-CoA合成酶（OCS）催化草酸而来。针对三七素生物合成途径不清楚、关键酶基因未知、积累规律和环境因素影响缺乏了解等科学问题，本项目拟通过关键酶（OCS，SAT，BIAS）基因克隆和功能验证、HLCP检测三七素含量变化和基因表达关系、干旱胁迫对三七素积累关系等内容的研究，将探明三七素积累和分布规律，并部分解析其生物合成途径，深入了解三七品质形成机理。

三七素作为三七止血的主要活性成分，其是用于治疗外伤出血等症状的多种传统药方发挥作用的有效成分。本项目结合已有的关于三七素中间体的报道，从新推测了三七中三七素的合成途径，基于不同年限、不同组织与不同处理的三七转录组数据挖掘到了参与三七素合成的11条候选基因，并对其进行了基因克隆、酶活验证、烟草瞬转与稳转实验。基于酶活验证的结果我们也构建了无细胞合成三七素的体系。同时对三七不同组织、不同时期、不同个体以及与不同近缘种之间三七素含量进行了测定与对比。同时也还探讨了PEG6000、茉莉酸甲酯与N素分别对三七中三七素积累的影响情况。新的路径我们弥补了之前OCD酶的空缺与新的反应底物的选择，我们发现PALP和OCD反应不能催化L-DAP的形成；L-DAP和草酰辅酶A可自发反应生成ODAP，而不需要BAHD基因的参与，并且烟草瞬转结果也不能确定BAHD是否能催化ODAP的产生；AAE7基因能够催化草酸和乙酰辅酶A合成草酰辅酶A。成功获得OCD和BAHD烟草转基因阳性植株，为后续的其它基因验证提供了便捷，同时结合前期候选基因的酶活验证为三七素合成基因的功能提供了参考依据。三七是三七素的最佳来源植物；三七素在三七花蕾中的含量最高，其次是根状茎和主根，幼苗以及茎和叶片也有较高含量的三七素；三七植株主要部位中三七素的含量均随着年龄的增长而显著提高；但三七素的含量与三七个头大小（头数）并无明显的相关性。PEG6000模拟干旱使三七素的积累显著提高；高浓度的茉莉酸甲酯与氮肥也会导致三七叶片中ODAP含量的显著增加。