创伤弧菌Lol系统及其脂蛋白转运功能的研究

Vibrio vulnificus is the pathogen of marine animal and human being. Lipoproteins are the important bacterial cell membrane componets and virulent factors. There is few researches on the lipoprotein virulent factors in pathogenic vibrio, and so far no study on the transport mechanism of those factors. This project will use methods like protein-protein interaction study, conditional knockout of essential gene and construction of protein functional mutant to study the Lol lipoprotein transport system in V. vulnificus. The project will identify new lipoproteins and their Lol transport/stay signals, study the interactions in Lol system components and the interaction between the Lol components with lipoproteins, and demonstrate the function of Lol system in lipoprotein transport. Basing on these study, the project also study whether Lol system will control the transport of surface lipoprotein IlpA. Finally, the project will analyze the roles of Lol system and lipoproteins in the pathogenisis of V. vulnificus. The research results will ultimately enrich the basic theory of membrane biosynthesis and protein export in bacterium, and lay foundations of establishing the target for screening new anti-bacteria medicine, developing highly effective subunit vaccine and new antigne surface-expression system.

创伤弧菌是海水养殖动物与人共患的致病菌。脂蛋白是细菌细胞膜的重要组分和毒力因子。国内外对致病性弧菌的脂蛋白毒力因子的研究较少，对其转运调控机制方面的研究尚无开展。本项目运用蛋白相互作用研究、必需基因条件敲除、蛋白功能突变体的构建等技术手段，开展创伤弧菌脂蛋白Lol转运系统的研究。项目将鉴定脂蛋白及其Lol转运/滞留信号，研究Lol系统各组分之间及组分与脂蛋白间的相互作用，明确Lol系统在脂蛋白转运中的功能，并在上述基础上研究Lol系统对表面展示脂蛋白IlpA的转运调控机制，分析Lol系统及脂蛋白在创伤弧菌致病过程中的作用。研究结果将丰富弧菌膜生物合成及蛋白质分泌的基础理论，为进一步筛选新型抗菌药物确立靶标，为研制高效亚单位疫苗、开发新型抗原表面展示系统奠定基础。

本项目首次系统地对一种广泛存在的海洋细菌创伤弧菌的脂蛋白及其转运系统进行了研究，获得一些成果，表述如下：课题组获得了能在革兰氏阴性菌中可调控高水平诱导表达各蛋白基因的广宿主系统，成功建立了外膜小体OMV法进行脂蛋白的膜定位方法。利用该技术准确定位已知的外膜脂蛋白及膜蛋白。项目研究了创伤弧菌中Lol转运系统底物脂蛋白的分泌机制，发现创伤弧菌脂蛋白的细胞分泌机制与革兰氏阴性菌中普遍的“+2规则”有较大差别。创伤弧菌中部分脂蛋白的+2位的Asp，可作为内膜滞留信号；但表面展示脂蛋白IlpA（+2D）突变体蛋白仍分泌到外膜；实验还发现了N端序列未包含+2Asp的多个内膜脂蛋白。分泌机制的进一步深化研究，将为弧菌脂蛋白的表达、分泌、应用提供有力理论支撑。项目组对创伤弧菌中的Lol系统同源基因的5个蛋白LolA-E进行了细胞定位，发现在创伤弧菌中LolC、LolD、LolE三个蛋白存在相互作用，并且Lol系统蛋白与弧菌脂蛋白也具有相互作用，参与了脂蛋白在细胞膜间的转运。多个Lol系统蛋白的突变在创伤弧菌中引起菌株显著的生长缺陷，进一步研究发现，Lol基因的突变抑制了细菌细胞膜生物合成，并通过σE途径、cpxR途径、RcsB途径诱导了细胞膜应激反应，从而激发一些效应因子的表达，改变了细菌的生理代谢情况。突变体实验证明了Lol基因参与细胞膜生物合成，是细菌生长必须基因，为今后筛选特异性的抗菌药物打下良好基础。本项目还利用已确定含脂蛋白正确修饰、分泌信号的IlpA蛋白N端序列与其他保护原构建重组脂蛋白作为创伤弧菌重组脂蛋白新型亚单位疫苗，实验数据表明，重组脂蛋白完全进行正确脂修饰，动物模型实验表明新型重组脂蛋白具有良好的免疫保护作用。新型脂蛋白疫苗的进一步开发应用，预计将有可观的环境、经济及社会效益。