延伸因子结合蛋白2调控干扰素抗乙型肝炎病毒的作用及其机制研究

Interferon α (IFN-α) is one of the main antiviral agents for treatment of chronic hepatitis B (CHB). However, IFN-α-based therapy for CHB patients is limited by a low response rate and significant side effects. In the previous study, we identified elongation factor Tu GTP binding domain containing 2 (EFTUD2), a nuclear protein involved in pre-mRNA splicing, is a regulator of IFN’s antiviral effects in vitro. Some preliminary experiments indicated that baseline levels of EFTUD2 expression were significantly higher in the liver tissue of CHB patients with response compared with those with no response to IFN-α treatment. Furthermore, EFTUD2 could affect the anti-HBV ability of IFN-α. In this project, we propose to carry out further clinical validation, and then evaluate whether EFTUD2 regulate IFN-α mediated antiviral effect in HBV cell culture model. We will explore which signaling pathway is responsible for EFTUD2’s role in regulating IFN-α mediated anti-HBV response. We plan to perform high-throughput screening of small molecule chemical compound libraries to identify the inducers of EFTUD2, and confirm the specific inducers promoting EFTUD2 expression in the nuclear of primary hepatocytes infected with HBV, as well as hastening the clearance of HBV after combining with interferon treatment in HBV cell culture model. The studies in this grant proposal will help to find the novel small molecule drugs targeted at EFTUD2, and provide more treatment options for CHB patients with poor IFN-α response.

干扰素α是治疗慢性乙型肝炎主要药物之一，但因其应答率低及较大的副作用而限制了该药的临床应用。近期申请人发现一种具有剪接pre-mRNA功能的核内蛋白质分子EFTUD2可调控干扰素抗病毒作用。预实验发现慢性乙型肝炎干扰素治疗出现HBeAg血清学转换患者的肝组织EFTUD2基线表达水平显著高于无应答患者，以及EFTUD2表达下调可影响干扰素抗HBV能力。本项目拟在此基础之上进一步临床验证，并通过细胞模型研究EFTUD2对干扰素抗HBV作用的调控，论证EFTUD2通过何种信号通路影响干扰素抗HBV效应。最后通过小分子化合物库高通量筛选出能够靶向正调控EFTUD2表达的分子诱导剂，并在HBV感染细胞模型上验证该诱导剂能否促进EFTUD2肝细胞核内高表达，以及联合干扰素治疗是否有助于HBV的清除。以本研究为基础开发新的分子靶向免疫调节药物，将为干扰素治疗应答不佳的慢性乙型肝炎患者提供更多的治疗选择。

我国属于HBV感染的中度流行区，据估算慢性乙型肝炎患者约2000～3000万例。慢性乙型肝炎抗病毒治疗尽管有较多的药物选择，但仍存在诸多不足，如核苷（酸）类似物难以清除病毒复制模板cccDNA，干扰素应答率低且副作用较大等。优化现有抗病毒策略固然仍具有特定价值，但随着患者“功能性治愈”需求的日益增长，国内外诸多学者已开始探索免疫治疗新靶点和新型抗病毒药物，以期治愈该病。. 本课题组前期研究发现一种具有剪接pre-mRNA功能的核内蛋白质分子EFTUD2，可调控干扰素的抗病毒作用。预实验研究发现慢性乙型肝炎干扰素治疗出现HBeAg血清学转换患者的肝组织EFTUD2基线表达水平显著高于无应答患者，以及EFTUD2表达下调可影响干扰素抗HBV能力。本项目在此基础上进一步深入研究。首先通过细胞模型研究EFTUD2对干扰素抗HBV作用的调控，证实EFTUD2具有抗HBV感染能力并影响干扰素抗病毒效果，RNA免疫共沉淀结合高通量测序（RIP-seq）后分析发现，EFTUD2通过剪接ISGs（MX1、EIF2AK2、OAS1等）pre-mRNA来发挥其正向调控干扰素抗病毒作用。结合生信预测，利用双荧光素酶报告基因挑选出具有最强活性的EFTUD2启动子序列hEFTUD2pro-0.5kb，将其与LUC基因整合并稳定转染HepG2细胞，建立Epro-LUC-HepG2细胞系。利用上述细胞系作为筛选模型，在小分子化合物库中高通量筛选出能够靶向正调控EFTUD2启动子活性的诱导剂，进一步验证其对EFTUD2表达的上调作用，最终挑选出能够显著促进EFTUD2在肝细胞核内高表达且细胞毒性较低的小分子化合物（Plerixafor、Resatorvid）。最后，利用HBV体外复制模型和感染模型进一步证实Plerixafor和Resatorvid具有抗病毒活性，且联合恩替卡韦或干扰素治疗有助于HBV的清除，而这种抗病毒作用是通过靶向EFTUD2实现的。. 本项目首次证实宿主固有免疫相关基因 EFTUD2对IFN-α抗HBV效应的调控机制，将有助于评估慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前机体的免疫状态，从而改善干扰素抗病毒治疗效果及远期预后。同时筛选出能够上调EFTUD2表达的小分子诱导剂，也为今后开发新的分子靶向免疫调节药物奠定了基础。