钠离子通道突变介导小菜蛾对氰氟虫腙抗性机理研究

The voltage-gated sodium channels of insects are responsible for the generation and propagation of action potentials in excitable cell in response to membrane depolarization. Metaflumizone is a novel sodium channel blocker insecticide (SCBIs) of semicarbazone class. At present, the diamondback moth (DBM) has developed medium resistance to this insecticide and the resistance mechanisms remain to be proven. In the present study, resistance inheritance to metaflumizone in DBM will be studied, The relationship between the expression level of sodium channels mRNA and metaflumizone resistance, and between alternatively spliced sodium channel transcripts and metaflumizone resistance will be verified; Verifying the function difference in resistant and susceptible strains by site mutation, in vitro expression of subunits including stable mutations in Xenopus oocytes, and two electrode voltage clamp techniques to find the resistance related mutations; Identifying the miRNAs that involved in the metflumizone resistance regulation and evaluate their functions. The objectives of these research is to clarity the molecular mechanisms of SCBIs resistance in DBM, prolong the life of metaflumizone and provide theoretical basis for resistance management.

昆虫钠离子通道对细胞动作电位的形成和传递起至关重要作用。 氰氟虫腙是具有全新作用机制的钠离子通道抑制剂，目前小菜蛾已对其产生抗性，其抗性机制有待探明。本项目在研究小菜蛾对氰氟虫腙抗性遗传方式的基础上，研究小菜蛾钠离子通道基因mRNA表达量及选择性剪接与小菜蛾对氰氟虫腙抗性的关系；采用定向突变、爪蟾卵母细胞体外表达和双电极电压钳技术验证敏感和抗性品系钠离子通道的功能差异，探究与抗性相关的突变位点；筛选、鉴定小菜蛾与氰氟虫腙抗性相关的miRNA并研究其在调控小菜蛾抗药性中的作用机制。通过以上研究，揭示钠离子通道在小菜蛾对氰氟虫腙抗性分子机制中的作用，为深入了解昆虫对钠离子通道抑制剂抗性机制，延长氰氟虫腙的使用寿命和小菜蛾抗性治理提供理论依据。

小菜蛾（diamondback moth，DBM）Plutella xylostella（L.）是主要危害十字花科作物的世界性害虫，氰氟虫腙（metaflumizone）是一种新型的缩氨基脲类杀虫剂，对小菜蛾具有良好的防治效果。通过室内连续37代筛选，获得对氰氟虫腙具高水平抗性（RR=933.90）的小菜蛾抗性品系（Meta-SEL）。交互抗性测定结果表明，Meta-SEL品系仅与茚虫威存在中等水平交互抗性，与多杀菌素、乙基多杀菌素、阿维菌素、高效氯氰菊酯、丁醚脲、氯虫苯甲酰胺、BT、溴虫腈和氟啶脲等9种杀虫剂不存在交互抗性或存在负交互抗性。抗性遗传方式研究结果表明，小菜蛾对氰氟虫腙抗性为多基因控制的常染色体不完全隐性遗传。适合度代价研究表明，Meta-SEL品系卵期缩短，1龄和2龄幼虫发育历期延长，蛹期、APOP、TPOP和世代周期延长。Meta-SEL品系2龄幼虫存活率下降，且相对适合度代价为0.78。增效剂试验结果表明，与敏感品系相比，Meta-SEL品系中MFOs活性显著增强，但仅增加1.13倍；TPP、DEM和PBO等3种增效剂在小菜蛾抗性和敏感种群中对氰氟虫腙的增效作用均不明显，表明代谢机制不是小菜蛾对氰氟虫腙产生抗性的主要作用机制。通过RT-PCR技术获得小菜蛾Meta-SEL和SS品系钠离子通道的cDNA序列，Meta-SEL品系钠离子通道cDNA基因在结构域ⅡS6和ⅢS1连接处缺失了6个氨基酸，其在SS品系中的表达频率高于Meta-SEL品系；同时在ⅣS6处发现第1809位的氨基酸由苯丙氨酸（F）突变为酪氨酸（Y），其突变频率高达（94.64%）。由此可见，F1809Y位点突变与小菜蛾对氰氟虫腙产生抗性密切相关。在无氰氟虫腙汰选的情况下，Meta-SEL品系小菜蛾对氰氟虫腙的抗性从1087.85倍降至1.23倍，表明小菜蛾对氰氟虫腙的抗性不稳定。利用16S rDNA测序发现，Meta-SEL品系肠道共生菌多样性显著高于SS品系，表明肠道共生菌可能在小菜蛾对氰氟虫腙抗性发展过程中发挥重要作用。本研究明确了小菜蛾对氰氟虫腙抗性产生的规律、抗性遗传方式、适合度代价以及抗性机制，揭示了小菜蛾对氰氟虫腙抗性进化的分子机理。研究结果对延缓小菜蛾对氰氟虫腙抗性发展以及小菜蛾抗性有效治理具有重要的理论和现实意义。