茚虫威抗性小菜蛾para通道基因分子克隆及功能分析

本研究拟在前期研究的基础上，将以本实验室汰选的茚虫威抗性小菜蛾品系（RR 310左右）为供试材料，采用分子生物学技术和双电极电压钳技术研究敏感和茚虫威抗性品系小菜蛾para通道的分子差异及其对药理性质的影响，旨在找出与抗性相关的突变位点，明确小菜蛾对茚虫威的靶标抗性的分子机理，从而在分子水平上对抗性进行早期预警，为抗性治理提供更精确信息。同时了解para通道不敏感性对其它药剂结合位点的影响，即para通道的药理性质是否改变，有利于阐明不同药剂之间的交互或负交互抗性的分子机制，并从抗性角度设计新杀虫剂的分子结构及其构型提供直接依据。

以本实验室汰选的茚虫威抗性小菜蛾品系（RR 455）为供试材料，采用RT-PCR结合Race技术克隆了敏感和茚虫威抗性品系小菜蛾para通道基因，通过比对，发现抗性品系para通道基因核苷酸发生了6个碱基的变化，分别为第50位的A→G，53位的C→A，74位的C→A，194位的C→A，2400位的A→G，2427位的T→C。进一步比对氨基酸序列，其中有3个位点的核苷酸的变化导致了氨基酸发生了替换，分别为第64位氨基酸D→E，800位的氨基酸K→E，809位的氨基酸Y→H。经与跨膜预测结构比对发现，其中800位的氨基酸K→E，809位的氨基酸Y→H替换均位于跨膜区，第64位氨基酸D→E替换不在跨膜区。而后构建了小菜蛾para通道基因表达载体，并成功在爪蟾卵母细胞中表达抗性和敏感品系的para通道基因，采用双电极电压钳技术测定茚虫威和DCJW稀释液灌注对卵母细胞电流的变化数值，结果为敏感和抗性para亚基茚虫威与产生电流反应之间的方程式为y=1.5800x+4.4580(R2=0.7354)；y=1.9760x+5.8380(R2=0.9828)敏感和抗性para亚基对茚虫威的EC50值分别为1.51×10－3M，1.11×10－3M，差异不大。敏感和抗性para亚基DCJW与产生电流反应之间的方程式为y=1.004x+6.958(R2=0.9829)；y=1.014x+7.018(R2=9845)。敏感和抗性para亚基对DCJW的EC50值分别为1.17×10－7M，1.20×10－7M，差异也不大。同时以小菜蛾para通道基因为依据，采用分子设计结合计算机辅助设计并合成了50多个化合物，经生物测定发现3个化合物具有开发的潜力。