抗烯啶虫胺褐飞虱解毒代谢基因P450转录调控机制研究

The overexpression of cytochrome oxidase (P450) induced the metabolic resistance of pests to insecticides. Previous study demonstrated that P450 mediated the metabolic resistance of Nilaparvata lugens to nitenpyram, but the transcriptional regulation mechanism remains unclear.The purpose of this study is to : 1) Identify the key resistance-related transcription factors by transcriptome data and qRT-PCR analysis, and study the regulation of the P450 genes by luciferase reporter gene detection system and point mutation; 2) Identify resistance-related miRNA and lncRNA according to RNA-seq and bioinformatics approach, and analyze their regulation of the P450 genes by RNAi and luciferase reporter system. Through these studies, the key transcription factors that play an important role in the P450 overexpression will be revealed, and the metabolic resistance mechanisms of transcription factors, miRNA and lncRNA to nitenpyram in N. lugens will be elucidated. The expected results will provide a theoretical basis for comprehensively revealing the metabolic regulation mechanism of pests to neonicotinoid insecticides, and can also enrich the theoretical system of insect molecular toxicology.

多功能氧化酶（P450）过表达可诱导害虫对杀虫剂的代谢抗性，申请人在前期的研究中明确了P450介导褐飞虱对烯啶虫胺的代谢抗性，但其转录调控机制尚未明确。项目申请人拟：1）结合转录组数据以及qRT-PCR分析鉴定抗性相关关键转录因子，并通过荧光素酶报告基因检测系统以及点突变等技术研究其对P450基因的调控作用；2）利用RNA-seq以及生物信息学方法鉴定抗性相关miRNA和lncRNA，并通过RNAi和荧光素酶报告系统等研究其对P450基因的调控作用。通过以上研究，明确介导P450过量表达的转录调控关键因子，揭示转录因子、miRNA和lncRNA在褐飞虱对烯啶虫胺的代谢抗性机制中的作用。预期研究结果为全面揭示害虫对新烟碱类杀虫剂的代谢调控机制提供理论依据，亦可丰富昆虫分子毒理学理论体系。

褐飞虱是亚洲国家水稻生产上重要害虫之一，在水稻产区造成重大损失。褐飞虱已对包括烯啶虫胺在内的多种杀虫剂产生不同程度的抗性。前期研究发现细胞色素P450多功能氧化酶和酯酶活性增强与褐飞虱对烯啶虫胺抗性密切相关，但对其介导的代谢抗性机制缺乏系统深入研究。本研究基于室内褐飞虱敏感品系和采自河南信阳的田间种群，通过室内连续多代汰选，获得两个抗烯啶虫胺的褐飞虱室内抗性品系。交互抗性测定结果揭示烯啶虫胺与吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、氟啶虫胺腈、呋虫胺、环氧虫啶、醚菊酯和异丙威之间存在交互抗性。增效剂实验结果发现PBO和TPP对两个抗性品系具有显著的增效作用，且两个抗性品系褐飞虱的P450和CarE的比活力均显著高于敏感品系，推测P450和CarE参与褐飞虱对烯啶虫胺抗性进化。转录组分析结合qRT-PCR发现共有9个P450基因在两个抗性品系中均显著上调表达，其中CYP6ER1、CYP302A1和CYP3115A1表达水平与抗性发展趋势密切相关。基于RNAi沉默上述三个P450基因可显著恢复抗性品系的敏感性。此外，转基因果蝇过表达进一步明确了CYP6ER1的过表达介导了褐飞虱对烯啶虫胺的抗性。.基于基因组和全长转录组共鉴定29个羧酸酯酶基因。系统发育分析显示29个CarE基因分布于7个进化枝，其中β-酯酶进化枝显著扩张。组织特异性表达分析发现15个β-酯酶基因在中肠或脂肪体中高表达，且16个CarE基因可被烯啶虫胺显著诱导表达。此外，CarE1、CarE2、CarE9和CarE19在两个抗性品系中均显著上调表达。RNAi实验进一步证实CarE1的过表达介导了褐飞虱对烯啶虫胺的抗性。.为进一步明确解毒酶基因在抗性品系过表达的调控机制，通过Small RNA测序共鉴定褐飞虱221个miRNAs，基于miRNA-靶基因预测软件分析发现novel_85和novel_191分别靶向CYP6ER1和CarE1的ORF区域，进一步通过双荧光素酶实验证明了互作关系。此外，体内注射novel_85和novel_191类似物或抑制剂可分别显著抑制或促进CYP6ER1和CarE1的表达，进而影响褐飞虱对烯啶虫胺的敏感性。表明novel_85和novel_191分别反向调控CYP6ER1和CarE1的表达进而介导褐飞虱对烯啶虫胺的抗性。.研究结果为全面揭示褐飞虱对烯啶虫胺的代谢调控机制提供了重要的理论依据。