PxGST3介导的小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性分子机理研究

The resistance mechanism to chlorantraniliprole in the diamondback moth is a popular research field because emergence and development of resistant to this insecticide was quite quick in this pest. The applicant’s study showed that the glutathione-S-transferase (PxGST) played an important role in the resistance of diamondback moth to chlorantraniliprole. The high level expression PxGST3 gene was obtained from a resistance population. Expression and enzymatic activity of the PxGST3 gene indicated that it was an important part of metabolism mechanism to the chlorantraniliprole. However, the resistance mechanism to the chlorantraniliprole still keep unclear. Based on our previous research, RNAi technology will be used to reveal function of the PxGST3 gene. The key amino acid sites will be located by homology modeling and molecular docking of the PxGST3 gene encoding protein. After mutating the key amino acid sites, those related genes will be heterologous expression. Continuing to separate those genes, the metabolic activity of the natural protein and mutant protein to chlorantraniliprole will be compared. Hopefully, the interaction pattern of PxGST 3 and chlorantraniliprole will be explained, and the role of metabolic detoxification gene PxGST3 on resistance mechanism to chlorantraniliprole in the diamonback moth will be clarified. This research will give us new ideas to management of resistance pest and early diagnosis of resistance.

小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗药性产生和发展速度快，其抗性机理成为研究热点。申请人所在项目组通过前期研究发现谷胱甘肽-S-转移酶（PxGST）在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中发挥重要作用，得到了在对氯虫苯甲酰胺高抗性的小菜蛾种群中高表达的代谢解毒基因PxGST3基因，进行了该基因的表达与酶活性分析，证明该基因在氯虫苯甲酰胺代谢中发挥重要作用，但其机理尚不清楚。本申请项目在此基础上，拟利用RNAi技术对PxGST3基因进行功能验证，通过对PxGST3基因编码蛋白序列进行同源建模与分子对接，找到其活性中心的关键氨基酸位点，定点突变关键氨基酸位点，异源表达并分离基因产物，比较研究天然蛋白与突变蛋白对氯虫苯甲酰胺的代谢活性，探索PxGST3与氯虫苯甲酰胺的互作模式，明确解毒代谢基因PxGST3介导小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺的作用机理，为害虫抗药性的早期诊断与治理提供新思路。

小菜蛾是一种世界性的十字花科害虫，其抗药性治理一直是一大难题，其对新型药剂氯虫苯甲酰胺抗药性的快速产生，使小菜蛾防治缺乏有效药剂，给十字花科蔬菜产量和品质造成极大影响。抗性机理的明确是抗性治理的基础，小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理成为研究热点。项目组通过前期研究发现谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中发挥重要作用，得到了在对氯虫苯甲酰胺高抗性的小菜蛾种群中高表达的代谢解毒基因PxGST3基因，进行了该基因的表达与酶活性分析，结果表明该基因在氯虫苯甲酰胺代谢中发挥重要作用。在此基础上，本研究利用荧光定量PCR方法对PxGST3基因在小菜蛾体内的时空表达特性进行了分析，结果表明，PxGST3基因在中肠和脂肪体中表达量较高，在血淋巴的表达量最低。同时利用RNAi技术沉默PxGST3基因，沉默后24h测定了小菜蛾体内谷胱甘肽-S-转移酶活性和小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性，结果表明，当沉默率达70%时，谷胱甘肽-S-转移酶活性与对照相比活性下降61%。室内生物活性测定结果表明，小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性有所降低，敏感性增强，dsRNAGST3处理组LC50为44.55mg/L，抗性倍数分别由1287.74倍下降到193.69倍。通过对PxGST3基因编码蛋白序列进行同源建模与分子对接，两者结合力为-7.21kcal/mol，其活性中心的关键氨基酸位点为His50，对该位点进行了定点突变，异源表达并分离了相关基因产物,获得的天然蛋白与突变蛋白浓度分别为1.3和3.6mg/L。利用HPLC比较研究了天然蛋白与突变蛋白对氯虫苯甲酰胺的体外代谢活性，结果表明，小菜蛾的PxGST3体外可代谢氯虫苯甲酰胺，突变蛋白代谢活性略低于天然蛋白。研究结果明确了PxGST3在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中起重要代谢作用，所筛选的dsRNA可用于防控小菜蛾，为小菜蛾抗性治理提供新思路。