决定梨矮生性状的PcDw的精细定位及其候选基因的鉴定研究

As to the practical problem of lacking of excellent gene resources in breeding new dwarf pear cultivars, in this study, based on the cultivar 'Nain Vert' from a seedling variant, with the dwarf trait previously confirmed to be controlled by a single dominant gene PcDw, centralized on the goal of exploring the sequence information, structure character and analyzing functional regulation about this gene, we will further narrow down the region of PcDw locus on the chromosome by fine mapping using the hybrid population with the target trait segregation. In the anchored region, the candidate of PcDw will be inferred through genes searching and their functional analysis and sequences comparsion, which can be further determined by deeping sequencing. Then, the dwarf phenotype effect of the candidate gene can be validated by genetic transformation and RNA interference in plants such as tobacco and pear. Finally, the dwarf gene PcDw would be expected to be identified. By structural and functional analysis, the molecular mechanism of this gene would be revealed and its dwarf function could be explained. This work would provide important molecular proofs for efficient utilizing of this gene resource in breeding new pear cultivars with dwarf tree architecture.

本项目针对梨树矮生型新品种选育中缺乏优良基因资源的实际问题，以矮生型实生变异梨品种"Nain Vert"为材料，在前期证实其矮生性状受控于显性单基因PcDw的工作基础上，围绕解析其基因序列信息、结构特征和调控功能这一科学目标，以目标性状的杂种分离群体为试材，深入进行PcDw基因的精细定位研究，进一步缩小其在染色体上的定位区间；在锚定的区间内，通过基因搜索、功能分析及序列比较，并结合该区域的深度测序分析，推断PcDw的候选基因；通过植物（烟草、梨）的遗传转化和RNA干扰来证实候选基因的矮生表型效应，鉴定出决定梨矮生性状的PcDw基因，通过结构与功能的分析，解析其分子形成机制及其致矮功能，为梨树矮生型新品种育种中这一基因资源的有效利用提供重要的分子依据。

优良基因资源对梨树矮生型新品种选育具有重要意义。来自西洋梨的实生变异品种‘Nain Vert’的矮生性状呈质量性状遗传特征，受控于一个显性基因PcDw。本研究中，围绕解析PcDw基因的序列信息、结构特点和调控功能这一科学目标，进行的相关研究以及获得的主要结果如下：（1）用3个不同的矮生型梨和4个不同的普通型梨为亲本，构建了4个关于矮生型/普通型性状的杂交分离群体。以这些群体为植物材料，依据梨和苹果基因组间高度的相似性和染色体的共线性特点，以二者的基因组序列为基础，设计合成引物，用分离群体分组分析原理，鉴定获得了一组与PcDw位点紧密连锁的SSR及SNP标记；同时，用2b-RAD简化基因组测序技术结合群体上的高通量熔解曲线分析，也鉴定获得了一组与PcDw位点连锁的SNP标记。依据获得的DNA分子标记，确定了PcDw基因在西洋梨基因组物理图谱中的位置区间。（2）分别对矮生型和普通型梨旺盛生长期的茎尖组织进行了转录组测序，鉴定出了一组在两种表型间差异表达的基因。根据DNA分子标记定位结果，结合基因差异表达情况，鉴定出了4个PcDw位点的候选基因。同时，从部分矮生型和普通型杂种中克隆了这些基因的编码序列以及启动子序列，并在两种表型间进行了差异分析。（3）构建了候选基因与绿色荧光蛋白的融合表达载体，转化烟草，用激光共聚焦扫描电镜法观察了候选基因编码蛋白的亚细胞定位位置。构建了候选基因的过表达载体以及RNAi干扰载体，将其进行了烟草和梨的遗传转化，并获得了一批转基因植株。（4）通过石蜡切片和扫描电镜法，观察发现矮生型梨在茎、叶组织解剖结构上有区别于普通型的显著特征。（5）对几个与茎生长有重要影响的基因，例如与油菜素内酯合成与调控有关的PcDWF1和PcBRU1也进行研究。获得的结果对深入解析矮生性状形成机制、了解基因间的互作具有重要意义。