天然活性分子Isatin抗神经母细胞瘤转移的作用及分子机制研究

Neuroblastoma (NB) is one of the most common solid tumors in childhood that accounts for 15% of all pediatric cancer-related deaths. It is well-known that early metastasis is the major cause of the poor outcome and death of NB. However, there is no accepted therapeutics for NB metastasis due to the lack of knowledge about its molecular mechanisms. Isatin, an endogenous indole in mammalian tissues and ?uids, possesses a wide range of biological activities. Our recent studies have demonstrated that Isatin has an anti-tumor effect（Eur J P 2008，2013）. In our preliminary study, we are excited to find that Isatin could strongly inhibit the metastatic of NB, and this effect might be related to the PI3K/Akt pathway. The hypothesis of our proposal is that Isatin may have an anti-metastasis effect on NB through the PI3K/Akt pathway. The hypothesis will be tested both in cultured cells in vitro and in mice in vivo by integrative approaches. The signal molecules involved in PI3K/Akt pathway will be analyzed by fluorescence quantity RT-PCR and Western Blot. The siRNA and PI3K inhibitor will be applied to determine the effect of Isatin on PI3K/Akt pathway. The targeting molecules of Isatin will be further identified by the affinity labeling and proteins flight mass spectrometry technology. The other potential molecules that may be involved in Isatin-mediated effect on NB metastasis will be screened by phosphoralated protein chip combined qPCR chip technology. Currently, metastasis is still a well-known key challenge of NB. The proposed study, if it is successful, will identify a novel modality, as well as its-related molecular mechanisms, that could be used in the prevention and treatment of NB metastasis.

早期转移是神经母细胞瘤（NB）的重要特征，是NB患儿的主要死因，故控制转移是决定预后的关键。Isatin是存在于动植物中的天然活性分子。申请者前期研究证实Isatin有抗肿瘤活性（Eur J P 2008，2013），之后发现其能明显抑制NB转移，且能下调PI3K/Akt通路的p-Akt，据此推测Isatin可能通过PI3K/Akt通路抗NB转移。本项目拟利用NB转移瘤细胞系和可视化动物模型明确Isatin抗NB转移的作用，并探讨其分子机制：①研究其对PI3K/Akt信号通路的影响；②应用siRNA和PI3K抑制剂下调PI3K验证之；③采用亲和标记法结合蛋白飞行质谱技术探究其作用靶点，即是否通过与膜上受体结合调控该通路；④借助磷酸化蛋白芯片结合qPCR芯片，进一步筛选Isatin抑制NB转移的关键分子。本研究旨在阐明Isatin抗NB转移的作用及分子机制，以期发现NB转移治疗的潜在靶点。

早期转移是神经母细胞瘤（NB）的重要特征，是NB患儿的主要死因，故控制转移是决定预后的关键。Isatin是存在于动植物中的天然活性分子。申请者前期研究证实Isatin有抗肿瘤活性（Eur J P 2008，2013），之后发现其能明显抑制NB转移，且能下调PI3K/Akt通路的p-Akt，据此推测Isatin可能通过PI3K/Akt通路抗NB转移。本项目拟利用NB转移瘤细胞系和可视化动物模型明确Isatin抗NB转移的作用，并探讨其分子机制。 本实验细胞水平实验结果表明，Isatin 对SH-SY5Y 细胞的侵袭、迁移和增殖能力有明显的抑制作用，并呈现出浓度依赖关系。本课题组前期的研究表明，Isatin 可以通过下调Cyclin D1 的表达诱导细胞周期阻滞，通过下调Bcl-2、Survivin 和上调p53 的表达促进SH-SY5Y 细胞凋亡。Isatin 诱导SH-SY5Y 细胞周期阻滞、细胞凋亡、抑制侵袭和迁移可能是通过Isatin 降低了STAT3 第705 位酪氨酸残基的磷酸化，降低活化的STAT3 实现的。作用机制方面的研究结果发现，Isatin发挥作用的信号通路可能主要依赖线粒体，一方面Isatin可以降低线粒体膜电位，从而诱发细胞色素c，caspase级联反应，诱导细胞凋亡，另一方面，Isatin又可作用于线粒体外膜上的单胺氧化酶，通过细胞转移相关的ROS、HIF、MMP等发挥作用，入核抑制转录因子活化，抑制肿瘤细胞的增殖、血管生成和侵袭转移。本课题组实验研究还发现，Isatin作用48h后，mTOR的下游信号分子FAK的Tyr397的磷酸化水平降低，FAK磷酸化过程受到影响，使得paxillin的磷酸化水平降低，从而影响了SH-SY5Y细胞骨架重排和细胞运动性。因此，Isatin可能通过活化AMPK，降低mTOR的磷酸化水平，从而影响SH-SY5Y细胞的侵袭和转移。动物实验结果显示，isatin对神经母细胞瘤裸鼠转移瘤模型，具有明显的抗肿瘤转移作用，而且，与化疗药合用，具有减毒增效的作用。本实验结果支持isatin作为抗神经母细胞瘤转移治疗的候选药物，或者作为化疗药减毒增效的辅助药物。