肝脏免疫调控蛋白LSECtin同配体的相互作用研究

新型肝脏免疫调控蛋白LSECtin可负调控活化的T细胞，在肝脏免疫耐受中发挥重要的作用，活化T细胞的CD44分子是其发挥功能的内源性配体，本项目拟从构象运动性的角度采用SDSL-EPR技术研究溶液中LSECtin/CD44的相互作用机制。通过构建一系列的半胱氨酸点突变体，经SDSL-EPR检测首先获得溶液中这些位点的构象运动性信息，继而在结合钙离子、甘露糖和GlcNAc等单糖后研究LSECtin-CRD结构域不同位点的构象运动性变化；在此基础上检测LSECtin同活化T细胞CD44结合过程中蛋白分子动态折叠变化，位置取向，以及重要氨基酸位点构象运动性变化，最终获得LSECtin/CD44相互作用的分子机制。鉴于LSECtin极具肝炎疾病治疗的潜力，LSECtin/CD44相互作用的分子机制研究对于LSECtin的药理功能研究具有重要的临床价值和意义。

hLSECtin在肝脏免疫耐受调节中具有负调控活化T细胞的作用。hLSECtin/CD44受体-配体分子对是介导hLSECtin粘附活化T细胞的分子基础。本项目应用SDSL-EPR技术检测hLSECtin主要功能结构域CRD上不同位点的构象运动性特征，研究了hLSECtin/CD44相互作用的分子机制。通过生物信息学分析，构建了hLSECtin-CRD单/双Cys点突变蛋白模型；通过Tat标签载体实现hLSECtin-CRD点突变蛋白的高效可溶性表达，并建立了高效可溶性表达膜蛋白的方法；通过改进CW-EPR距离计算软件，合成双自旋距离刻度分子标尺，在8-14 Å范围建立了稳定的双自旋距离刻度分子标尺及其距离刻度与校正的实验方法；通过EPR波谱测量与分析，获得了hLSECtin-CRD结构域在结合Ca2+、单糖以及CD44分子前后不同位点的构象运动性和距离变化规律。结合以上信息，获得了hLSECtin蛋白在分子结合过程中部分构象变化特征，揭示了hLSECtin 同CD44分子的相互作用的部分分子机制，为其肝脏免疫耐受调控功能提供了结构基础，并可以为深入开展C型凝集素分子的功能研究提供基础和新的技术手段。