水稻穗特异表达miRNA的功能及其与靶基因的互作分析

miRNAs specially expressed in rice spiklets play a crucial role in regulating reproductive development of rice. More than 20 special miRNAs have been identified by analysis of chip expression Profiling data in rice, but most of their functions are not clear. It has become an important method to study the function of miRNAs using over-expressed miRNAs to inhibit the expression of their target genes, which is also employed in this study. 13 unknown miRNAs specially expressed in spikelet are studied in this programme，and overexpressed vectors are designed using these miRNAs, respectively. Then these vectors are transformed into the wildtype plants, the transgenic plants from which are used to reveal the functions of these miRNAs and the relationship between the miRNAs and their targets by means of morphology and molecular methods, the results of which will contribute to an improvement to the traditional theory of floral organ development, and provide a new idea for exploring the mechanism of reproductive development in rice.

水稻穗特异表达的miRNA对水稻的生殖发育起着非常重要的调控作用，目前利用芯片表达谱分析鉴定的水稻穗特异表达的miRNA有20多个，但大部分的功能还没确定。而通过过量表达miRNA抑制靶基因的表达已成为研究miRNAs功能的一种重要手段。本项目拟通过过量表达这些水稻穗特异表达的miRNA以研究其功能。我们选择了13个功能未知的穗特异性表达的miRNA，分别构建过量表达载体，并转化野生型水稻，获得它们的过量表达植株，并利用各种形态学方法和分子生物学手段对转基因植株的表型和表达进行分析，以阐明这些miRNA的功能及其与靶基因之间的互作关系。这将是对传统花器官发育理论的补充和完善，并为探索水稻生殖发育的机制提供新的思路。

植物miRNA对大多数编码细胞分化和参与机体生长发育调节的转录因子都具有重要的调控作用，从而参与植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌、信号转导以及对外界环境胁迫的应答等生物学过程。在重要的粮食作物水稻中，共发现约400多个miRNA，但是大部分的功能还有待验证。Jeong等（2011）利用生物芯片的方法，识别了在水稻幼苗、根、茎和穗特异表达的miRNA，本项目则对其中穗特意表达的miRNA进行研究。主要构建了miR5791，miR169e ，miR396a，miR394， miR5793，miR5519，miR5792，miR5789，miR818f，miR5806， miR5485，miR5488，miR5822，miR528和miR1873的过量表达载体，并遗传转化水稻品种日本晴和中花15，其中miR169e，miR396a，miR5792，miR5822，miR394和miR1873成功获得了阳性过量表达植株。通过对各miRNA过量表达植株的表型进行观察，发现过量表达miR396a明显影响了水稻的营养生长和生殖发育。因此进一步对miR396a的功能和作用机制进行了深入研究。生物信息学分析表明，水稻miR396a的靶基因主要包括9个OsGRF基因和几个其它基因。过量表达miR396a，其靶基因的表达水平明显发生变化，且具有一定的时空表达差异性。形态学研究表明过量表达miR396a导致植株矮化和叶片细小，并且过量表达植株的株高与miR396a 的表达水平呈正相关。切片分析发现植株矮化是由于细胞数目减少引起的，而定量PCR分析结果也显示细胞分裂基因H4-2 和OsRAN2的表达水平显著下降。同时miR396a的过量表达也使小穗和小花的发育发生了异常，如穗长变短，花器官数目增加、发育畸形和花粉不育等，定量PCR分析进一步表明miR396a通过间接调控花器官发育相关基因如MADS类基因及小穗花序结构决定基因如FZP 和LAX1来控制水稻小花及花器官的发育。以上研究结果表明miR396在水稻营养生长和生殖发育中同时具有重要的调控作用，为通过调节miR396的表达水平来优化水稻的农艺性状奠定了基础。