四环三萜类化合物安五酸和甘五酸抗丙型肝炎病毒的有效靶点及作用机制

Refractory infection of hepatitis C virus (HCV) is resistant to the current standard of care which consists of pegylated interferon alfa in combination with ribavirin and protease inhibitors. Therefore, it is of great necessity to find out the potential key targets to inhibit viral infection at different steps of HCV life cycle. Our group has long been engaged in screening anti-HCV natural products from nearly hundreds of plants. We have isolated two tetracyclic triterpenoid compounds, anwuweizic acid and ganwuweizic acid, and demonstrated their anti-HCV activities. Previous work suggests that both compounds showed strong anti-HCV activities, significantly influencing virus binding to the cellular receptors and blocking HCV cell entry. IC50 of anwuweizic acid and ganwuweizic acid was 13.41μg/ml and 10.21μg/ml，respectively). These two compounds with distinct targets from other antivial drugs have been applied for two state invention patents. Based on the previous work, our project aims to pinpoint the exact target(s) of tetracyclic triterpenoid acids on HCV/cell receptor complexes, using the existing HCV cell models in vitro, infectious animal models(Tupaia) and receptors identification technology. We will also elucidate the molecular and cellular machanisms on their antiviral activities from two aspects of both virus and host cell by HCV infectious model systems both in vitro and in vivo. Our project will provide theoretical foundation and experimental base for development of innovative anti-HCV drugs with self-intellectual property rights.

难治性丙肝对干扰素联合利巴韦林和蛋白酶抑制剂治疗不敏感，急需寻找能在丙肝病毒（HCV）生活周期的不同节点上抑制病毒的新靶点。本课题组长期从事抗HCV药物研究，前期筛选了近百种药用植物，从华中五味子果实中分离到2种具有抗HCV活性的四环三萜类化合物-安五酸和甘五酸。前期工作显示：安五酸和甘五酸干扰HCV与细胞受体结合，阻止病毒的细胞入侵，具有显著的抗HCV活性（IC50分别为13.41μg/ml和10.21μg/ml），其作用靶点与目前所有抗HCV药物均不相同，已申请2项国家发明专利。本课题拟在上述基础上，利用我们已有的HCV体外细胞模型、感染动物模型（树鼩）和受体鉴定分析技术，精确定位四环三萜酸与HCV/细胞受体互作的靶点，从病毒配体和细胞受体两个层面及体外体内两个感染模型系统，阐明其抗HCV作用的分子和细胞机制。课题实施将为开发具有自主知识产权的新型抗HCV药物提供理论支撑和实验依据。

丙型肝炎病毒（HCV）入侵是一个高度协调的多步骤过程，存在着许多天然的、具有较高基因屏障的抗病毒治疗靶点。由于入侵抑制剂干扰的是病毒生命周期最开始的阶段，此时病毒基因组并未释放，因此具有同时预防与治疗病毒感染的作用。本课题组前期利用HCV体外感染模型，即细胞来源的HCV（HCVcc）和HCV假病毒颗粒（HCVpp），从数百种天然药用植物来源的化合物中，高通量筛选出具有抗HCV活性的来源于传统保肝中药五味子的四环三萜类化合物甘五酸（SZA）和安五酸（AWA）。SZA和AWA细胞毒性较小，可显著抑制HCVcc和HCVpp感染靶细胞。应用不同基因型包膜蛋白包装的单周期HCV假病毒颗粒，我们发现SZA和AWA的抑制活性具有覆盖多基因型的特点，且两者能阻断HCVpp入侵原代人肝细胞，后者是更接近和模拟人肝细胞感染病毒的情况。通过动力学实验显示，SZA和AWA的作用靶点皆处于病毒感染早期入侵阶段的结合后步骤。然而，密度梯度超速离心实验提示，SZA和AWA并不干扰病毒本身的脂密度和RNA水平的分布。同时，两个化合物也不影响细胞表面入侵受体表达量和病毒的结合活性。利用荧光染料DiD标记病毒进行膜融合动态监测实验，发现SZA和AWA可能通过破坏病毒与细胞膜融合的过程抑制病毒感染。而通过荧光染料Prodan，我们检测了SZA和AWA对脂质膜流动性的影响，发现细胞脂质膜的流动性在SZA和AWA的作用下升高。此外，SZA和AWA能显著抑制细胞间病毒的传递，且SZA与干扰素或VX-950联合运用后具有协同抑制病毒感染的效果。天然植物来源的SZA和AWA具有显著的抗HCV感染的活性。两者的作用机制为干扰了HCV感染早期的必要步骤即病毒入侵，与目前传统的DAA的治疗靶点不同，可作为HCV感染预防及对现有疗法的补充，具有广阔的应用前景。目前相关课题研究共发表标注论文9篇，申请并获授权专利两项。