丙肝病毒包膜蛋白中构象依赖的关键组氨酸影响病毒感染的机制研究

丙型肝炎病毒（HCV）入侵是病毒感染的首要环节，也是抗病毒策略的重要靶标，其包膜糖蛋白（E1、E2）与子代病毒组装和新一轮病毒感染密切相关。目前对HCV入侵过程中包膜蛋白构象改变及其机制方面知之甚少，而组氨酸（His）作为唯一一个质子化状态变化接近于病毒融合阈值（~pH6）的氨基酸，被认为在低pH依赖的HCV感染中起关键作用。本课题拟采用遗传突变方法，构建含单个或多个His突变的HCV感染性克隆，体外转录出病毒RNA，电穿孔导入表达或不表达CD81的Huh7细胞，检测各突变对病毒复制、感染的影响；化学发光法检测上清液中核心蛋白含量，分析各突变对病毒组装与释放的影响；用已建立的膜融合系统，检测各突变对低pH依赖的HCV膜融合活性的影响；最后，运用分子动力学模拟实验对上述结果进一步验证，从而确定HCV包膜蛋白中数个关键保守His残基的生物学功能及作用机制，为HCV入侵抑制剂的开发提供新靶点。

丙型肝炎病毒（HCV）入侵是病毒感染的首要环节，其包膜糖蛋白（E1、E2）与病毒新一轮感染密切相关。因组氨酸（His）的质子化状态变化接近于病毒融合阈值（~pH6），被认为在低pH依赖的HCV感染中起关键作用。本课题通过氨基酸序列比对，结合E2蛋白结构特点，选取了三个关键部位的保守组氨酸位点（H421，H490和H621）。采用遗传突变方法，构建了含His点突变的亚克隆质粒和全长质粒，体外转录出全长的野生型和各突变型病毒RNA，通过电穿孔的方法，将其分别导入HCV易感细胞Huh7.5.1细胞，发现各突变与野生型病毒具有相似的电穿效率。H421A突变体的病毒滴度、RNA复制和蛋白表达水平均稍高于野生型病毒，而H490A和H621A突变体均低于野生型病毒，尤其是H621A上清无明显感染性。由于Huh7.5.1细胞支持感染性病毒颗粒的再次感染，故用不表达CD81分子的Huh7细胞来研究各突变对单周期病毒复制、感染性的影响。发现H421A突变体的感染性比野生型高1~2倍，H490A突变体比野生型低约15倍，而H621A突变体未检测出感染性。对电穿后P1/6d细胞内HCV RNA和病毒蛋白（core和NS3）的表达情况进行检测，发现H421A突变的病毒RNA拷贝数和蛋白表达高于野生型，而H490A和H621A突变均与野生型类似或稍低；H421A突变体的特异感染性稍高于野生型，H490A突变体比野生型低3倍，提示H421A突变体能增强病毒复制和蛋白表达，但不影响子代病毒的入侵能力；H490A和H621A突变体虽不影响病毒复制与蛋白表达，但均能显著降低子代病毒的感染性，说明这两个组氨酸残基影响的是病毒入侵过程。进一步构建了含点突变的HCV E2蛋白重组表达质粒，并在细胞中表达；利用原核表达纯化的CD81大胞外环（LEL）蛋白检测野生型和突变型E2蛋白与CD81的结合活性。发现与野生型E2蛋白的CD81结合活性相比，H490A-E2蛋白的CD81结合活性下降，而H621A-E2蛋白的CD81结合活性极低或甚至完全丧失，这也与上述感染表型的结果相符。综上，本课题从HCV E2包膜蛋白中鉴定出了三个关键且保守的组氨酸残基，阐明了它们在整个病毒生活周期中的生物学功能及其影响机制，尤其是H490和H621在CD81介导的HCV入侵过程中发挥了重要作用，为病毒入侵抑制剂的研发提供了新靶点。