五味子抗丙肝病毒化合物安五酸和甘五酸构效关系与作用机制研究

Our previous study demonstrated that tetracyclic triterpenoids: anwuweizic acid and ganwuweizic acid, isolated from plants of Schisandra, had excellent anti-HCV activities. The IC50 of anwuweizic acid and ganwuweizic acid on HCVcc were 13.41μg/ml and 10.21μg/ml, respectively, and on HCVpp were 7.00 μg/ml and 9.99 μg/ml (Granted patent number: ZL201210013268.X, ZL201210013269.4). The preliminary study showed the anti-HCV mechanism of anwuweizic acid and ganwuweizic acid was different from the drugs used in clinic. Anwuweizic acid and ganwuweizic acid inhibit HCV cell entry and influence virus infection significantly by blocking HCV binding to its receptors. Based on the previous work, chemical constituents from S. sphenanthera, and isolation and preparetion of anwuweizic acid and ganwuweizic acid for structural modification would be investigated by modern chromatograph, spectrum methods and chemical synthesis. And all synthesized and isolated compounds would be evaluated for their anti-HCV activities and SAR by using the mature HCV cell models in vitro. Further study on elucidate the molecular and cellular mechanisms on its antiviral activity from three aspects of virus, host cell and virus-cell interaction would be also carried out to illuminate the mechanism and target. Our project would be benefit for furhter development of a kind of new target anti-HCV drugs with self-intellectual property rights.

前期研究发现五味子中的四环三萜酸类化合物：安五酸和甘五酸具有很强的抗HCV活性作用。安五酸和甘五酸二者对丙型肝炎病毒HCVcc的IC50分别为13.41μg/ml和10.21μg/ml，对HCVpp的IC50分别为7.00 μg/ml和9.99 μg/ml，并且二者抗HCV作用机制与现有药物不同，可以通过阻断HCV与细胞受体结合，阻止病毒侵入靶细胞（已申请发明专利并获授权ZL201210013268.X，ZL201210013269.4）。本研究拟用多种现代色谱方法和波谱技术继续研究南五味子的化学成分及制备安五酸和甘五酸，对其进行结构修饰和构效关系讨论、利用已经建立起来的HCV体外细胞模型进行活性评价，从病毒配体、宿主细胞受体以及病毒/受体互作三个层面，阐明其抗HCV作用的分子和细胞机制以及作用靶点，为研发具有自主知识产权的新靶点天然抗HCV药物提供重要的科学依据。

本课题从三种五味子属植物分离鉴定了48个化合物，其中Coccinic acid（CA）为首次从南五味子中分离得到。抗HCV活性测试结果表明三萜中CA的活性最好，多数木脂素类化合物具有较好的抗HCVcc和HBV的活性，说明五味子中的三萜和木脂素是其抗肝炎作用的物质基础。建立了五味子中SA，AA和CA的含量测定方法，对7批不同产地的五味子中SA和CA含量进行了测试，发现北五味子中SA和CA含量很低，二者比例约为2：1；而南五味子中，SA和CA含量远远高于北五味子，且二者比例约1:1.5~3。结果对于南北五味子在药用方面的选择，以及南北五味子药材质量的管控提供了基础。设计合成了系列SA衍生物，多数化合物显示出抗HCVcc的活性，其中十个化合物 3, 5c, 5e, 5g, 5f, 5g, 5h, 5p, 5q和6显示出优于SA，且细胞毒性较低。初步作用机制研究表明5h和6具有较好的抑制HCVpp入侵Huh7细胞的作用。设计合成甘草次酸衍生物，大部分化合物表现出抗HCVcc的活性，其中8个化合物（2，5a，5c，5d，6a，6d，6e，6g，6h和6i）的抗HCV活性均是GA的至少2倍。甘草次酸3位羟基氧化、成肟活性增强，其中氧化后得到的化合物2抗HCV活性明显最好（IC50 = 0.37 ug/ml ），是GA的将近1000倍，提示3位羰基结构可能为抗HCV活性增效团。此外还设计合成了UA和OA衍生物并进行了体外抗HCVcc活性测试。SA的抗HCV作用机制研究表明：SA可显著抑制HCVcc和HCVpp感染靶细胞。SA在不同型别的 HCVpp 中的抑制效果一致，并能阻断 HCVpp 入侵原代人肝细胞。其作用靶点位于病毒感染早期入侵阶段的结合后步骤。SA对病毒本身的脂密度和 RNA 水平的分布，及细胞表面入侵受体表达量和病毒结合活性并无显著影响。SA 可能通过破坏病毒与细胞膜融合的过程抑制病毒感染。同时，细胞脂质膜的流动性也在 SA 的作用下升高。此外，SZA能显著抑制细胞间病毒的传递，且与干扰素或 VX-950 联合运用后具有协同抑制病毒感染的效果。SA这种作用与目前传统的 DAA 的治疗靶点不同，可作为 HCV 感染预防及对现有疗法的补充，具有广阔的应用前景。