TGFBI-integrin-FAK信号转导通路在紫杉醇诱导多倍体肿瘤形成和耐药中的作用

多倍体肿瘤是异倍体肿瘤的前身，具有多倍体亚克隆的肿瘤预后更差。前期工作发现：紫杉醇能诱导多倍体形成，而且能形成多倍体的细胞系较其它细胞系有更强的抗药性并低表达细胞外基质蛋白TGFBI；课题组有关多倍体形成机制研究课题已受国家自然科学基金资助（30872969）。本课题以两株对紫杉醇反应截然不同的乳腺癌细胞系为研究对象（一株以形成多倍体细胞为特点，一株以凋亡为特点），分别通过转染/敲除TGFBI基因，分析TGFBI与细胞对紫杉醇反应性的关系，并进一步深入研究人重组TGFBI作用后及应用integrin抗体和RNA干扰FAK分层次阻断integrin-FAK通路后，细胞周期、凋亡、微管稳定性、紫杉醇敏感性和DNA倍体的变化，探讨TGFBI通过integrin-FAK通路抑制多倍体肿瘤形成、使细胞对紫杉醇敏感的分子机制，为提出通过细胞外基质抑制多倍体形成为基础的新的预防肿瘤耐药的策略奠定基础。

本项目按照课题申请书的研究计划，以两株对纺锤丝毒性药物紫杉醇反应截然不同的乳腺癌细胞系为研究对象（一株MDA-MB-231 以形成多倍体细胞为特点，一株Hcc1806 以凋亡为特点），分析TGFBI 与紫杉醇反应性及多倍体形成的关系。即将TGFBI 转染于MDA-MB-231，敲除TGFBI 于Hcc1806，观察细胞紫杉醇反应性的变化。.应用TGFBI载体转染MDA-MB-231细胞，应用western blot 检测转染效果，并检测转染TGFBI和empty vector后在紫杉醇的作用下细胞周期和凋亡的变化。结果显示过表达TGFBI后，MDA-MB-231细胞在紫杉醇作用后G2/S期比例增加，MTT法显示，与对照组（空载体）比较，过表达TGFBI后细胞对紫杉醇的敏感性增加，表现出更高的抑制率。同时Annexin V法显示细胞凋亡率有所增加。在Hcc-1806细胞应用siRNA knockdown TGFBI 基因，检测RNA干扰的效果，并检测knockdown TGFBI基因后细胞周期和凋亡的变化。结果显示knockdown TGFBI后，Hcc-1806细胞在紫杉醇作用后G2/S期比例减少，细胞凋亡率减少。.本项目另一个突破性的进展是用纺锤丝毒性药物nocodazole处理乳腺癌MDA-MB-231细胞后，流式结果显示，MDA-MB-231细胞随着接触该类药物时间的延长不是以出现凋亡为主，而是以形成多倍体为特征，利用流式分选术分选获得多倍体细胞，经有限稀释法克隆筛选得到具有克隆能力，能够长期稳定存活和传代的多倍体细胞T -MDA-MB-231。应用免疫荧光法证实T-MDA-MB-231为多倍体。课题组应用western blot 检测比较MDA-MB-231和T-MDA-MB-231细胞TGFBI的表达情况，结果显示T- MDA-MB-231较MDA-MB-231低表达TGFBI。将含有TGFBI的载体和空载体分别转染T-MDA-MB-231细胞，MTT法显示，与对照组（空载体）比较，过表达TGFBI后细胞对紫杉醇的敏感性增加，表现出更高的抑制率。.为了进一步分析TGFBI与多倍体形成的关系，项目组在前期研究发现在纺锤丝毒性药物nocodazole作用下MDA-MB-231细胞形成多倍体的前期基础上，将含有TGFBI的载体和空载体分别转染MDA-MB-231