结核性脑膜炎患者脑脊液γδT淋巴细胞对结核分枝杆菌吞噬作用研究

Mycobacterium tuberculosis are a facultative intracellular parasites and cleaned by the phagocytosis of the innate immune system and cellular immunity of adaptive immune system. The prognosis of tuberculosis is determine by the survival or death of Mtb within the phagocytes and the classic prefessional phagocytes are always the host cells for persister. Previously, we detected intracullular MtB and their antigen segments within γδT lymphocyte in the cerebrospinal fluid(CSF) of tuberculosis meningtis patients by our modified acid-fast stain method and it has been reported that γδT lymphocyte phagocyting bacterial can functioned as antgen-presenting cells ans initialed cellular immunity. Thus we proposed γδ T lymphocyte in the CSF of tuberculosis meningtis patients can phagocyte myobacterial tuberculosis，and trigger a host defense mechanism. We try to explore the professional phagocytosis、antigen presenting function of T lymphocyte to the MtB; and then eluciade the professional phagocytosis and antigen presenting mechanisms of γδT lymphocyte by using our modified ZN staining、immunohistochemistry、 confocal and transmission electron microscope in the CSF samples of TBM patients and coculture of MtB and T lymphocyte.

结核分枝杆菌是胞内寄生菌，基于固有免疫系统的的吞噬功能和获得性免疫系统的细胞免疫是消灭结核分枝杆菌的主要途径。结核菌在吞噬细胞内被杀死或者持留决定了结核病的预后，传统吞噬细胞往往同时是结核持留感染的宿主细胞。最近，我们通过改良抗酸染色方法在确诊结核性脑膜炎患者脑脊液γδT淋巴细胞内检测到结核杆菌及其抗原片段的存在。而最近研究表明γδT淋巴细胞可通过抗体依赖的吞噬作用发挥抗原呈递功能。我们提出假说：结核性脑膜炎脑脊液内的γδT淋巴细胞对结核分枝杆菌具有吞噬作用，并且触发宿主防御反应机制。我们拟通过对结核性脑膜炎患者脑脊液或外周血γδT淋巴细胞与结核杆菌共培养的标本，使用抗酸染色、免疫细胞化学、流式细胞、共聚焦及透射电镜等方法明确脑脊液内γδT淋巴细胞对结核杆菌的吞噬作用、阐明吞噬结核杆菌淋巴细胞的功能变化，并对淋巴细胞吞噬结核杆菌的分子机制进行初步探索。

项目背景：本研究起始于我们在临床研究中观察到结核性脑膜炎患者脑脊液T淋巴细胞内存在抗酸阳性的结核分枝杆菌这一发现。.主要研究内容：在前述研究基础上，我们首先使用改良抗酸染色和MGG染色双染确证了体内淋巴细胞对结核分枝杆菌吞噬现象的存在，在胸腹水的淋巴细胞内，我们发现其CD4阳性淋巴细胞内也存在对结核分枝杆菌的吞噬。进而，我们通过体外T淋巴细胞和卡介苗共培养研究观察T细胞对卡介苗的吞噬现象、机制和意义。.重要结果和关键数据：我们首先通过改良抗酸染色（金铵O）和CD3抗体对结核性脑膜炎患者脑脊液进行双标染色，并使用共聚焦进一步证实结核性脑膜炎患者脑脊液内的T淋巴细胞内可以检测到结核分枝杆菌，进而我们通过共聚焦、电镜、流式细胞和活细胞工作站证明了JurkatT淋巴细胞和原代培养的T淋巴细胞对灭活结核分枝杆菌和卡介苗的吞噬现象，然后通过建立的JurkatT淋巴细胞和BCG共培养的吞噬模型，对其机理进行了探讨，初步表明JurkatT淋巴细胞主要以胞饮作用吞噬卡介苗，阿米洛利可以抑制T细胞对卡介苗的吞噬作用。细胞松弛素D可以抑制这一吞噬过程，而血清内的补体可以促进吞噬。我们进而用纯化的小鼠T淋巴细胞和BCG共孵育，发现小鼠T淋巴细胞不同亚群在吞噬MTB过程具有不同特点，CD4+T细胞亚群Th1、Th2、Tfh均呈上调趋势，而Th17、Treg在24h时升高，后呈下调趋势。在此过程中，cGAS-STING通路参与并诱导I型干扰素IFNβ的生成，并调控与介导T淋巴细胞吞噬MTB过程中不同细胞亚群的分化及自噬产生。除此之外，我们在研究中还同时探讨了B细胞和中性粒细胞对卡介苗的吞噬作用及相关机理。.科学意义：本研究首次证实了T淋巴细胞对卡介苗具有吞噬作用，并初步阐明其机理，为进一步研究结核性脑膜炎的发病机制及干预策略提供新的思路。