TCR识别pHLA的结构机制研究

Peptides-HLA recognition is the most critical step for adaptive immune response. However, the structural information and mechanism of the TCR and pHLA interaction is still not completely understood. In our previous study, we found that the two-step binding model cannot sufficiently explain the molecular mechanism of TCR-pHLA interaction. According to substantial amount of experimental evidences, we proposed the "synchronised docking model" and "scan-clamp model "which TCR recognizes the antigen peptides and the HLA simultaneously or prior to HLA. In this project, we plan to obtain high affinity TCRs (HAT) by "molecular evolution" technology, and alanine substitution will be performed at the important residues of a-helix of HLA and the peptides to emphasize the roles of peptide and CDR during antigen recognition. Moreover, class II HLA-DP4 presented with NY-ESO-1（157-170） will be constructed for analysing further evidence that the recognition of pHLA by TCR was dominated by peptide and CDR3. We believe the study will reveal the key structural elements of TCR binding to pHLA and provide adequate evidences to prove our hypothesis, and to clarify the mechanism of pHLA recognition by TCRs.

TCR对HLA分子提呈抗原肽的识别是细胞免疫反应最关键的过程，然而TCR与pHLA相互作用的结构基础与作用机制仍然不完全清楚。通过前期的研究我们发现，现有的"两步法模型"并不能很好的解释TCR识别pHLA的分子机制，在大量实验证据的基础上我们提出了TCR识别pHLA分子的"同步对接模型"和"扫描锁定模型"，即TCR分子在识别pHLA的过程中对抗原肽和HLA分子的识别是同步进行或者抗原肽识别优先于HLA识别，而不是两步法模型所提出的HLA识别优先于抗原 肽识别。本项目拟通过"分子进化"技术获得高亲和性1G4 TCR，以高亲和力的1G4 TCR识别HLA0201-A2-NY-ESO为研究对象，通过对HLA a螺旋和抗原短肽的重要位点进行丙氨酸或甘氨酸替换的方法，来研究CDR在TCR的抗原识别过程中的重要作用。此外还通过构建能够提呈NY-ESO-1（157-170）短肽的HLA-DP4的II类HLA分子，来分析其能否得到1G4 TCR突变株同时识别I和II类HLA提呈的非常相似的抗原肽，进一步论证TCR分子识别pHLA过程由抗原肽主导而不是HLA主导的假说。

T细胞受体（T cell receptor, TCR）是T细胞膜表面识别各种抗原的免疫球蛋白超家族分子，在适应性免疫过程中发挥重要作用。但是TCR分子是通过何种方式识别pHLA分子，其相互作用的结构基础以及关键位点仍然不够清楚。在本项目中，我们首先针对TCR识别pHLA的机制问题，从两者结合面周边（HLA的α螺旋）和中心（抗原肽）两方面展开研究。通过噬菌体展示技术我们筛选出识别HLA0201-A2 NY-ESO-1 的高亲和性TCR 1G4（1G4 HAT），其亲和力达到了45.4 pM，比野生型提高了7万多倍。以此高亲和性TCR识别HLA0201-A2 NY-ESO-1为研究对象，我们分别构建了HLA α螺旋相关的5个突变体并合成了抗原短肽重要位点的丙氨酸替换的6种短肽突变体；通过测定不同突变体与高亲和性1G4 TCR的亲和力，我们发现α螺旋的突变对于识别影响不大，而抗原短肽中第5位色氨酸到丙氨酸的突变（W5A），则使得亲和力下降了接近3万倍，结合同源建模的数据，表明了抗原短肽在识别过程中起着重要的作用。这一机制的研究带出了第二方面的工作，即高亲和性TCR对与原有短肽相似的其他抗原肽的特异性研究。由于正常组织中可能存在与肿瘤抗原序列相似的抗原，外源引入的TCR分子除了能够识别肿瘤抗原之外还可能识别序列相似的正常组织的抗原，从而引起对正常组织的杀伤。因此，在临床上应用TCR时，抗原识别的特异性将会是安全性评价的重要因素之一。因此，我们选择人的总蛋白数据库对NY-ESO-1（157-165）SLLMWITQC的序列进行BLAST分析，通过比较我们得到了12条抗原肽与目标序列相似，来源于4种不同的正常蛋白。亲和力的数据表明其中一种短肽被HLA-A2提呈后与1G4 HAT结合的亲和力达到了0.1 nM，已经接近高亲和性1G4 TCR的结合强度。后续的杀伤实验表明：激活的T细胞能够成功的杀伤负载了该短肽的T2细胞。杀伤实验以及亲和力的数据表明我们对已知TCR安全性鉴定的方法是可行的，这对于降低未来应用TCR进行免疫治疗的风险具有重要指导意义。TCR识别抗原的异常将会导致自身免疫性疾病，对TCR 结构、功能、识别特异性以及识别抗原肽机制的研究有助于更准确地理解免疫反应的分子基础，为再设计TCR 结构和功能相关的药物以及相关疾病的免疫预防和治疗提供依据。