抗原特异TCR基因修饰T细胞TCR信号转导的机制研究

抗原特异TCR基因修饰T细胞临床应用受限的关键问题是其对靶细胞表现出较低的反应效力，目前关于其功能特性尚未完全了解。我们前期通过基因芯片技术发现弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）相关抗原特异TCR转基因T细胞的基因表达谱发生了变化，其中RAS/Erk信号通路的变化尤其明显，故本研究拟分析TCR基因修饰T细胞的Erk信号通路的特点。通过应用特异性信号通路关键激酶抑制剂（PD98059）干预，定量检测抑制前后TCR基因修饰T细胞活化相关细胞因子水平变化；Erk1/2的表达及磷酸化水平；c-Jun和c-fos的表达水平；电泳迁移率改变分析（EMSA）检测其核转录因子AP-1结合活性的变化等，探讨抗原特异TCR基因修饰T细胞的活化、增殖及TCR信号通路下游信号转导的调控机制，为研究TCR基因修饰T细胞的功能特性提供新的资料，试图为增强TCR基因修饰T细胞的特异性杀伤活性提供一个潜在的研究方向。

本研究的主要目的是分析弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）相关抗原特异TCR转基因T细胞Erk信号通路的特点及其活性状态对TCR转基因细胞TCR信号转导下游关键转录因子的表达和活化以及转基因T细胞细胞毒活性的影响。首先我们通过定量PCR及Western blot验证抗原特异TCR基因修饰T细胞的Erk激酶的活性是增高的，这与基因芯片检测的结果相一致。而转基因T细胞TCR跨膜信号转导的关键分子CD3ζ，TCR信号转导通路下游关键转录因子P38、c-fos、c-jun，以及T细胞分化关键调控因子EGR1、T-bet和GATA-3基因mRNA水平未发生明显变化。然后通过Mek激酶抑制剂（PD98059）抑制转基因T细胞的Erk信号通路的活性，抑制24 h时FCM检测发现CD25+CD69+T细胞比例明显下降；实时定量PCR检测CD3ζ、c-fos和c-Jun基因在mRNA水平的相对表达量较抑制前明显降低。EGR1和T-bet基因的mRNA水平也低于抑制前，两基因的相对表达量具有明显相关性，而GATA3基因则较高于抑制前。阻断Erk信号通路至48 h，TCR转基因T细胞的c-fos和c-Jun基因的表达量均较24 h时有所上升，但c-Jun蛋白的磷酸化水平则进行性下降。并且随着抑制时间的延长，P38基因在mRNA及蛋白水平的表达均呈现进行性增高。而NF-κB基因的相对表达量则未发生明显变化。体外特异性杀伤实验也发现抑制Erk信号通路24 h的TCR转基因细胞的细胞毒活性较抑制前明显降低，ELISA检测也发现其共培养上清中IL-2和IFN-γ水平明显降低，而IL-4水平则明显增高。而抑制48 h的TCR转基因T细胞的细胞毒活性有所恢复。其细胞毒活性的恢复可能与TCR下游P38信号通路等的活性代偿性增高导致TCR信号转导关键转录因子的活性恢复有关。另外，本研究还对DLBCL患者化疗前后外周血中的c-fos和c-Jun基因，EGR1、T-bet和GATA-3基因，TCR信号转导的其他关键转录调控因子TRAF6/TAK1基因的表达以及胸腺近期输出功能进行检测。.总之，本研究率先对TCR转基因T细胞Mek/Erk信号通路的活性及功能进行检测，并证实其对于维持TCR转基因T细胞的细胞毒活性至关重要。目前的结果为研究TCR基因修饰T细胞的功能特性提供新的资料。