结构域替换对TCR分子表达、组装和识别能力的影响

目前利用抗原特异性TCR基因修饰T细胞进行过继性回输已经成为肿瘤生物治疗中的研究热点，但是在基因修饰的T细胞中，导入的外源TCR分子有可能同内源TCR发生错配而产生识别抗原未知的杂合TCR分子，从而可能导致自身免疫病。我们在前期研究中表明，TCR基因修饰的T细胞中存在约30%的杂合TCR分子，因此有必要设法减少这种杂合TCR的产生。考虑到TCR与抗体同属免疫球蛋白超家族，结构非常相似，本研究拟利用抗体的恒定区替换掉TCR的恒定区结构域，同时为了不影响改造后TCR与CD3分子的结合，保留其跨膜区和胞内区序列，将其改造成一种三明治式的嵌合TCR分子。然后对其在T细胞内的配对组装、结合CD3分子的能力、以及识别抗原和传递活化信号的能力进行全面分析，以评价是否达到减少杂合TCR产生、增加外源TCR有效表达水平并保持其抗原识别特异性的目的，为TCR基因修饰T细胞的过继性治疗及其临床应用研究奠定基础。

T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）决定着T细胞的抗原识别特异性，将具有抗原识别特异性的TCR基因转入普通的T细胞中，将能够赋予该细胞特定的抗原识别能力。近年来，利用抗原特异性TCR基因修饰T细胞进行过继性回输已经成为肿瘤生物治疗中的研究热点。但是这种治疗方案尚存在一些亟待解决的问题：在基因修饰的T细胞中，导入的外源TCR分子有可能同内源TCR发生错配而产生识别抗原未知的杂合TCR分子，从而可能导致自身免疫病。我们在前期研究中表明，TCR基因修饰的T细胞中存在约30%的杂合TCR分子，因此有必要设法减少这种杂合TCR的产生。考虑到TCR与抗体同属免疫球蛋白超家族，结构非常相似，本研究拟利用抗体的恒定区替换掉TCR的恒定区结构域，同时为了不影响改造后TCR与CD3分子的结合，保留其跨膜区和胞内区序列，将其改造成一种三明治式的嵌合TCR分子。然后对其在T细胞内的配对组装、结合CD3分子的能力、以及识别抗原和传递活化信号的能力进行全面分析，以评价是否达到减少杂合TCR产生、增加外源TCR有效表达水平并保持其抗原识别特异性的目的。我们的研究结果表明，经过改造的嵌合TCR基因能够像未改造的TCR基因一样在宿主细胞中正常的表达；FRET分析表明，在没有内源TCR分子的细胞中，嵌合TCR分子两条链的FRET效率比未改造的TCR分子略微有些降低，但是差异并不显著，而在含有内源TCR分子的细胞中，嵌合TCR分子两条链的FRET效率则明显高于未改造的TCR分子，表明C区的替换能够有效地减少外源TCR分子与内源TCR分子间的错配；与CD3分子间的共定位分析表明，嵌合TCR分子能够与CD3分子相结合；将嵌合TCR基因转染T细胞，利用抗体活化后检测信号分子的活化和细胞因子的表达情况，表明嵌合TCR分子能够活化下游信号分子并诱导应答基因的表达；将嵌合TCR基因修饰的T细胞与靶细胞共孵育，杀伤效果表明，TCR基因修饰能够增强T细胞识别杀伤靶细胞的能力。此外我们还尝试采用其他方案对TCR基因进行了改造，以及利用突变抗原肽体外诱导反应性的T细胞克隆并扩增、鉴定其所编码的TCR基因。通过本项目的一些探索，为下一步的深入研究奠定了基础，也为TCR基因修饰T细胞的过继性治疗及其临床应用研究奠定了基础。