Ago2乙酰化在miRNA途径中的功能与机制

MicroRNAs (miRNAs) have broad regulatory roles on gene expression, therefore the miRNA pathway in organisms is precisely controlled. AGO2 is one of the most important regulatory factor in the miRNA pathway, because it is an effector of the miRNA-induced silencing complex (miRISC). In our preliminary work we have identified Ago2 acetylation and its sites, and found Ago2 acetylation can affect the activities of the gene silencing effects mediated by the miRNA pathways. The project will further explore molecular mechanisms of Ago2 acetylation regulating the miRNA pathway activities: Ago2 acetylation may affect the recruitment of some precursor miRNA (pre-miRNA) to form Ago2-pre-miRNA complexes, which can bind to Dicer/TARBP2 to promote the formation of miRLC (miRISC loading complex), thus ultimately influencing the biogenesis of a group of specific miRNAs and changing the miRNA expression profiles. We will also analyze the biological functions of Ago2 acetylation, including the activation of Ago2 acetylation by which signaling pathway and acetyltransferase/deacetyltransferase, the effects of acetylation-site mutant of Ago2 on tumor cell and xenografted tumor growth characteristics, and the correlation between Ago2 acetylation degree and tumorigeneis in clinical tumor samples, to finally clarify the physiological relevance of Ago2 acetylation regulating the miRNA pathways.

微RNA（miRNAs）对基因表达具有广泛的调节作用，故其在细胞内被精确调控。Ago2是miRNA途径中的一个最重要的效应蛋白。在前期工作中，我们鉴定了Ago2的乙酰化修饰及其位点，并发现Ago2乙酰化可以影响miRNA途径介导的基因沉默效应的活性。本项目将深入阐明Ago2乙酰化调控miRNA途径活性的新分子机制：即Ago2乙酰化可影响其直接招募一些前体miRNA (pre-miRNA)形成Ago2-pre-miRNA复合物, 而后者和Dicer/TARBP2结合促进形成装载体miRLC, 最终调控一群特异性miRNA的生成而改变miRNA表达谱。我们还将剖析Ago2乙酰化的生物学功能，包括Ago2乙酰化受何种信号及相关酶激活、Ago2乙酰化位点突变型对肿瘤细胞及移殖瘤生长特性的影响、临床肿瘤样本中Ago2乙酰化程度与肿瘤发生之间的相关性等，阐明Ago2乙酰化调控miRNA途径的生理意义。

miRNA（microRNA）对基因表达调控具有十分重要的作用，而其表达和功能的异常会引起人类多种疾病。在哺乳动物中，miRNA生成包括如下几个步骤：首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ作用下转录生成的pri-miRNA，随后被DROSHA-DGCR8剪切复合体加工形成pre-miRNA；在Ran-GTP和Exportin-5的共同作用下，pre-miRNA被运送到细胞浆中。接送，胞浆中的pre-miRNA与DICER、TARBP2和AGO2相互结合形成miRLC复合物后，pre-miRNA进一步被加工成熟并装载到AGO2蛋白上，从而形成miRISC沉默复合体。. AGO2是miRISC沉默复合体的一个核心效应蛋白。AGO2的生物学功能有两方面：第一，参与miRNA和siRNA介导的基因沉默效应；第二，参与部分miRNA的成熟加工。有研究表明，某些pre-miRNAs可与AGO2先结合形成miPDC复合物，再进一步与DICER、TARBP2共同形成miRLC复合物。但是，关于miPDC复合物形成的分子机制仍不十分清楚。. AGO2可以发生多种翻译后修饰，如羟基化修饰、磷酸化修饰、泛素化修饰、类泛素化修饰和核糖基化修饰等，这些修饰对AGO2稳定性、miRNA生成和miRNA介导的基因沉默均具有重要的调节作用。在本研究中，我们首次发现AGO2可以发生乙酰化修饰，其主要的修饰位点是K355、K493和K720。进一步，我们证明了P300/CBP是AGO2的乙酰化转移酶，HDAC7是AGO2的去乙酰化酶。通过miRNA高通量深度测序和生化实验，我们证明了AGO2在K493和K720位点的乙酰化修饰能特异促进miR-19b生成。我们注意到，pre-miR-19b1的环（loop）结构上含有特别基序UGUGUG。通过RIP等实验，发现乙酰化修饰AGO2可识别UGUGUG基序并招募pre-miR-19b1形成miPDC复合物（AGO2-pre-miR-19b1），从而促进miR-19b生成。更重要的是，通过临床数据库分析、临床肺癌组织芯片分析和小鼠移植瘤模型，证实了我们的假说，即AGO2乙酰化修饰通过调控miR-19b生成，进而促进肿瘤发生发展。本研究表明AGO2乙酰化修饰高表达可能会导致恶性肿瘤形成，这一理论可为肿瘤诊断和靶向治疗提供指导策略