酿酒酵母rDNA区的合成与功能分析

The ribosomal RNA coding genes (rDNAs) are the most abundant genes in the eukaryotic genome, resided at one or few locations in chromosome as tandem repeats with as many as hundreds of copies. The repetitive structure and highly active transcription of rDNAs make them the most vulnerable regions of the genome, and become the hotspots of homologous recombination, chromosome breakage and DNA repair loci. In addition, rDNAs not only participate the formation of ribosomes, which are responsible for translation of proteins. Recently works have also provided convincing evidences that rDNAs are critical for maintaining genome stability, cellular stress response, ageing and senescence. However, the underlining mechanisms how rDNAs are functioning in these processes are still in their infancy. In this proposal, we will use the budding yeast, Saccharomyces cerevesiae as the model, and combine methods developed in Synthetic Biology, Genetics, and Molecular Biology etc. to tackle the problem. The yeast strains with complete deletion of rDNAs from genomic locus will be generated and multiple mutations at rDNA will be constructed and tested. The mutated rDNAs can be used in the form of episomal plasmids or integrated into genome, at either original or a different chromosomal locus. By analyzing the phenotypes of these mutants, we can ask specific questions such as what are the function of conserved regions in non-coding regions of rDNA, what are the function of the expanded segments, how does the copy number of rDNAs affect genome stability and so on. Eventually, we could gain a deeper understanding of this unique region.

编码核糖体RNA的基因（rDNA）是真核生物体内数量最大、分布最特殊的一类基因，以串联重复基因簇的形式存在于基因组内，数目可高达数百个。基于基因结构的高度重复性以及高速转录活性，rDNA基因区是真核生物染色体上最为脆弱的部分，是同源重组、染色体断裂及修复的热点。rDNA基因区除了参与核糖体的形成及蛋白质翻译，同时对基因组稳定性、细胞应激、老化和死亡等非常重要，但其相关调控机理目前仍处于研究的最初阶段。本课题将在酿酒酵母中，结合合成生物学、遗传学和分子生物学等不同方法，利用基因组上rDNA区完全缺失的菌株，通过突变体库的构建、rDNA区在染色体上原位或者异位的重建以及带有不同突变体菌株的表型分析，系统研究rDNA中RNA编码区和非编码区的功能，进一步加深对rDNA高度重复区的功能和进化的认知。

编码核糖体RNA的基因（rDNA）是真核生物体内数量最大、分布最特殊的一类基因，以串联重复基因簇的形式存在于基因组内，数目可高达数百个。rDNA基因区除了参与核糖体的形成及蛋白质翻译，同时对基因组稳定性、细胞应激、老化和死亡等非常重要。此外，rDNA的内部转录间隔区（ITS）在植物和真菌中一直被当作DNA分子标签用于种属的鉴定。该序列能否被其他生物的相应序列替代而混淆物种鉴定是一个悬而未决的问题。本项目对rDNA中序列高度保守的元件的生物学功能开展了系统研究，通过对12号染色体（synXII）的设计合成，实现了rDNA区的敲除和重建，解析rDNA区对染色体高级结构形成与细胞生物学功能的关系。在synXII的组装过程中，rDNA区域首先被完整的保留下来，接着在合成染色体上被完全去除，利用高拷贝质粒上表达的rDNA支持细胞的存活。随后对rDNA进行修改，在基因组多个不同位置上利用修改后的rDNA实现了整个rDNA区的再生。在rDNA区的再生过程中，利用贝酵母（Saccharomyces bayanus）的序列替换酿酒酵母的ITS，重建并获得了另一个带有合成染色体的酵母。该酵母将被鉴定为贝酵母，但其他基因组序列都是酿酒酵母。随后，利用Hi-C技术分析了合成染色体rDNA区域被移除前后，以及在其他染色体上重建后的染色体3D结构，发现合成染色体序列的改变对整个基因组的高级结构不产生显著影响。然而，rDNA区域在其他染色体上的重建可以导致十二号染色体以及核仁在细胞核内位置的变化，同时造成染色体高级结构的调整。本研究表明课题组不仅能够设计、构建获得含有百万级碱基的合成染色体，并且实现了对高度重复的rDNA区进行编辑与操控，奠定了未来对其他超大、结构超复杂的基因组进行设计与编写的基础。与此同时，也证明了酵母基因组中rDNA区域及其他序列均具有惊人的灵活度与可塑性。通过改变rDNA内ITS而实现“物种置换”在一定程度上反映了进化的灵活性。