基于SlSCPx稳定细胞株高通量筛选昆虫生长抑制剂及抑制活性研究

In view of the important process of sterol carrier protein SlSCPx participating in cholesterol synthesis of ecdysteroid 20E and cell membranes to influence the growth and development of larvae of Spodoptera litura. This project will insert SlSCPx into the cell genome by using approaches of liposome transfection technique and finally acquire highly expressed SlSCPx stable cell line. Based on high-throughput cell-based screening system, nearly 10,000 kinds of synthetic chemical compounds will be screened. It can be further verified and identified by larval prothoracic glands cultured and the fed assay in vitro. It is hoped to obtain the effective insect growth inhibitors on pest control and lay a good theoretical for the further use of high-throughput cell-based screening system for effective insect growth inhibitors. It has important theoretical and practical significance for SlSCPx used on pest control.

以鳞翅目害虫斜纹夜蛾为研究对象，以中肠专一表达的固醇转运蛋白SlSCPx为靶标，针对其重要结合底物胆固醇合成细胞膜和蜕皮激素20E影响幼虫生长发育的过程，利用脂质体转染技术在重组酶作用下将SlSCPx插入细胞的基因组，建立高效表达的SlSCPx蛋白的稳定细胞株，基于建立昆虫生长抑制剂高通量细胞筛选系统，对近万种化学合成小分子进行筛选，获得抑制胆固醇吸收的化合物。再经离体前胸腺离体培养和体外喂食实验等生物学验证和鉴定，以期获得有效的昆虫生长抑制剂。本项目通过建立昆虫生长抑制剂的高通量细胞筛选系统，获得有效的昆虫生长抑制剂，为进一步利用细胞高通量筛选技术获得有效的昆虫生长抑制剂提供实验素材和理论参考，对SlSCPx在害虫防治方面具有理论和现实意义。

胆固醇不仅构成细胞膜，而且合成蜕皮激素，并参与各种生理活动。昆虫由于缺乏合成胆固醇需要的关键的鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶，故不能自身合成胆固醇，只能从宿主植物中吸收。干扰或阻断胆固醇的吸收、运输和转化，都将抑制昆虫的生长、发育和繁殖。固醇转运蛋白（Sterol Carrier Protein）是参与胆固醇吸收和转运的重要蛋白。建立基于SlSCP2稳定细胞株的抑制剂细胞筛选体系来筛选有效的昆虫生长抑制剂，对斜纹夜蛾乃至鳞翅目害虫的生物防治具有理论和现实意义。本研究完成以下研究内容：（1）高效表达SlSCP2 蛋白的稳定细胞株的建立。利用脂质体转染技术在重组酶作用下将SlSCP2整合到细胞染色体中，用500 μg/ml的潮霉素B淘汰未发生转化的细胞，单克隆扩大培养12代后获得转化并具有潮霉素B抗性的细胞，建立了高效表达的SlSCP2蛋白的稳定细胞株；（2）基于SlSCP2稳定细胞株的抑制剂细胞筛选体系的构建及有效性分析。胆固醇的剂量和时间效应结果显示，加入20 μM NBD-胆固醇继续培养6 h后，细胞内胆固醇的吸收达到最大。在该体系下可以进行有效抑制剂筛选；（3）高通量昆虫生长抑制剂的筛选。从MCE(MedChemExpress)公司购买的60种小分子化合物进行铺板筛选，获得胆固醇吸收抑制率高于45%的5个抑制剂分子7875622、7928456、7887064、7903470和7927235，且化合物7875622、7928456和7887064的抑制率达到50%以上。这些研究结果的获得，为进一步利用细胞高通量筛选技术获得有效的昆虫生长抑制剂提供实验素材和理论参考，对SlSCP2在害虫防治方面具有理论和现实意义。