真菌环状缩肽合成酶的催化机制及新型环状缩肽的重构合成研究

Fungal cyclooligomer depsipeptides possess a variety of biological activities including promising anticancer activities. They are assembled by cyclooligomer depsipeptide synthetases. In order to rationally engineer these giant modular synthetases for molecular diversity, it is critical to fully understand the catalytic mechanisms of these enzymes. In our preliminary studies, beauvericin synthetase and bassianolide synthetase, two significant fungal cyclooligomer depsipeptide synthetases, were reconstituted in an engineered Saccharomyces cerevisiae system. Based on the dissection and swapping of component modules from these two synthetases and the construction of their hybrid enzymes, the modules controlling the final product profiles were identified. Thus, this project aims to characterize the roles of several key enzymatic domains involved in cyclooligomer depsipeptides biosynthesis and determine the chain length control mechanism of these products by a combination of genetic and biochemical approaches. The proposed methodology includes site-directed mutagenesis of the conserved residues; dissection and recombination of domains; in vitro determination of enzymatic characteristics and intermediate products; and construction of intact hybrid enzymes. Accordingly, these synthetases will be reprogrammed to generate "unnatural" cyclooligomer depsipeptides. These studies will significantly advance our understanding of fungal cyclooligomer depsipeptide synthetases and create chemical diversity in natural bioactive products.

真菌环状缩肽具有广泛的生物学活性，包括潜在的抗肿瘤活性。它们由环状缩肽合成酶负责合成，充分了解这类巨型模块化酶的催化机制是对其进行合理设计、重构，合成新型天然产物分子的关键。本项目组前期用酿酒酵母表达系统重构了beauvericin合成酶及bassianolide合成酶的活性，对这两种重要的真菌环状缩肽合成酶的组成模块成功进行了拆分与交换，并构建了包含异源模块的杂合酶，初步确定了控制产物组成的酶结构区域。本项目拟在前期研究工作的基础上，通过保守氨基酸残基的定点突变、结构域的拆分与重组、酶学性质的测定、酶反应中间产物的分析，以及杂合全酶的构建，阐明酶的几个关键结构域在环状缩肽生物合成过程中的具体功能，揭示负责产物链长控制的结构域，进而对两种酶的特定结构域进行重构，合成一系列新型的环状缩肽产物。本项目的研究将对进一步了解真菌环状缩肽合成酶，创造更加多样化的真菌天然产物活性分子具有重要的意义。

真菌环状缩肽具有广泛的生物学活性，包括潜在的抗肿瘤活性。它们由环状缩肽合成酶负责合成，充分了解这类巨型模块化酶的催化机制是对其进行合理设计、重构，合成新型天然产物分子的关键。本项目组利用前期搭建的环状缩肽合成酶酿酒酵母重构表达系统，通过对两种重要的真菌环状缩肽合成酶，即beauvericin合成酶及bassianolide合成酶进行保守氨基酸残基的定点突变、结构域的拆分与重组、酶学性质的测定、酶反应中间产物的分析，以及杂合全酶的构建，阐明了酶的几个关键结构域在环状缩肽生物合成过程中的功能，具体包括：N-MT结构域对于最终产物环状骨架的合成不是必需的；两个T2结构域在环状缩肽合成酶催化产物形成过程中并非缺一不可，但它们的共同存在能够提升产物合成的效率；C2结构域负责催化产物中酰胺键的形成，C3结构域负责催化酯键的形成，而C1结构域对维持酶的整体结构是重要的；C3结构域是负责控制产物链长的关键结构域，且其只能特异性地环化具有特定链长的中间产物，如只能特异性地环化trimer中间产物，形成最终的产物beauvericin；基于上述链长控制机制，通过杂合酶的构建，合成了新型环状缩肽化合物FX1；只利用C2和C3两个结构域，实现了beauvericin的体外全合成，最终证明了环状缩肽合成酶在产物的合成过程中采用的是线性模式，即对初始底物采用“交替掺入”的方式合成最终的产物。本项目的研究结果对于全面了解真菌环状缩肽合成酶，创造更加多样化的真菌天然产物活性分子具有重要的意义。