具有双活性序列的环状抗菌肽设计及抗菌肽与生物膜相互作用机理研究

抗菌肽是具有杀菌功能的肽类活性物质，是宿主防御体系中天然免疫的一个重要组成部分。由于具有广谱的抗菌活性和低抗药性，抗菌肽被认为是抗生素的替代品和增效剂，在医药及食品防腐上具有较好的发展潜力。抗菌肽的结构特征和其抗菌活性具有密切的关系。本项目将重点探讨研究较少的具有环状结构的抗菌肽的结构特征和活性的关系。本项目将设计合成具有双活性序列及环状结构两个结构特征的抗菌肽，测试其抗菌活性、溶血性及毒性，以期筛选出具有高选择性的抗菌肽，并研究其与生物膜模拟体系亲和、插入、翻转、转移、聚集和破膜等各个步骤，探讨二者相互作用的机理。双活性序列有可能使抗菌肽的两亲性及阳离子性的结构特征强化，而环状结构有利于肽分子的结构稳定，因此有可能提高抗菌肽的活性。本项目将分别考察两个结构因素对抗菌肽活性的影响，从而为进一步的抗菌肽优化、设计，提高抗菌肽的选择性等方面提供研究基础。

本研究设计、合成了四组31条多肽，包含具有双活性序列的线性和环状多肽以及具有单活性序列的短链肽，考察了其杀菌活性，筛选出8条具有较高杀菌活性的多肽。在此基础上，进一步考察了这8条多肽的细胞毒性和溶血性，并采用电化学、荧光、紫外、朗缪尔膜天平等多种方法，以固体支撑膜、脂质体、单分子膜等为模型研究了这8条多肽的杀菌机理。同时采用计算模拟的方法考察了各多肽和细菌细胞膜的重要成分磷脂酰甘油之间的相互作用，计算了其结合能，从理论上解释其杀菌活性不同的原因。主要结果包括：.（1）单活性序列的短链肽普遍具有较低或者不具有杀菌活性（除combi-1），而将单活性序列加倍所获得的具有双活性序列的线性多肽普遍具有比较高的杀菌活性。 具有双活性序列的环状多肽性质相当或者低于线性多肽，但活性高于单序列多肽，因此将活性序列加倍有助于提高杀菌活性，该结论在三组多肽设计中得到印证。.（2）计算模拟的结果显示多肽和磷脂酰甘油的结合能和杀菌活性具有正相关关系。双活性序列线性多肽结构柔性较大，和磷脂酰甘油相互作用时具有更多的结合位点，作用力以静电和氢键为主，二者作用的结合能较大，破坏细菌细胞膜的能力较强，杀菌活性较高。而双活性序列环状多肽因形成环状结构，构型较为固定，因此和磷脂酰甘油的结合能降低，杀菌活性也降低。不同序列的环状多肽因所形成的环大小不同，结合能有差异，杀菌活性也不同。.（3）氨基酸组成对于杀菌活性具有重要作用。荷正电的多肽易于具有杀菌活性，且具有更大离域范围的精氨酸有助于提高杀菌活性。氢键的形成也有利于杀菌活性，因此带有羟基的氨基酸有助于提高杀菌活性。.（4）通过多种方法的研究，发现所设计多肽可与细胞膜成分产生相互作用，形成孔洞，造成膜的通透性升高，内部物质外流，或者钻入膜内产生破坏作用。. 该研究筛选出了3条具有较高杀菌活性，较低毒性和溶血性的线性多肽，具有进一步研究开发的潜力。本研究结果解析了双活性序列和环状结构对多肽杀菌活性的影响以及氨基酸组成的影响，为进一步的抗菌肽优化、设计，提高抗菌肽的选择性等方面提供研究基础。另外，计算模拟的方法为抗菌肽的杀菌活性预测从理论上提供了一定的依据， 利用该方法可在一定程度上预测抗菌肽的杀菌活性, 提高抗菌肽的研发效率, 为抗菌肽的设计与开发提供了新途径。