细菌中DNA磷硫酰化修饰限制系统与CRISPR-Cas系统的相互作用研究

DNA phosphorothioate (PT) modification is a physiological modification in the DNA backbone. DndABCDE five proteins use sulfur as the sixth element to replace the non-bridging oxygen in the DNA sugar-phosphate backbone in sequence-selective and Rp-specific manner. DNA PT modification is widespread in prokaryotes and constitutes a novel defense system with DndFGH showing similarity to methylation-based restriction-modification system. DndABCDE confer DNA PT modification and use it as a tag to distinguish‘self’and‘non-self’DNA, while DndFGH function as a ‘gatekeeper’ to recognize and destroy foreign DNA. CRISPR-Cas is regarded as a prokaryotic adaptive immunity system for protection, because it is able to memorize the encounters with infectious agent and attack it specifically afterwards. In this study, we set out to study the interaction of DNA PT defense system and CRISPR-Cas including the influence of the both defense systems to each other and the defensive behavior of CRISPR-Cas to PT modified invading DNA. We will also aim to analyze the influence of CRISPR-Cas to the PT features. Collectively, this will provide insights into the biological significance of DNA PT modification and the interaction with other biological pathways.

磷硫酰化修饰是DNA骨架上的生理修饰，其化学本质是DndABCDE 五个蛋白把硫原子作为第六元素序列特异性、Rp空间构象专一性地取代DNA骨架上非桥连的氧原子。磷硫酰化修饰在细菌中广泛存在，并在一些细菌中与DndFGH组成了类似于甲基化的修饰-限制系统。DndABCDE对宿主进行磷硫酰化修饰，并以此作为“自我”的标签，DndFGH则对外源无修饰DNA切割，是细菌的新型防御机制。而CRISPR-Cas系统是原核生物抵抗外源DNA的一种“获得性免疫”，对入侵者具有“记忆性”和“特异性”。 本项目拟鉴定磷硫酰化系统及CRISPR-Cas系统对彼此防御能力的影响，探究CRISPR-Cas系统对磷硫酰化的外源DNA抵御能力的变化，揭示CRISPR-Cas系统对DNA磷硫酰化修饰特征的影响，为最终阐明DNA磷硫酰化这一独特生理修饰的生物学意义及与其它生物学途径相互关系奠定基础。

DNA磷硫酰化修饰在细菌中广泛存在，并在一些细菌中与DndFGH组成了类似于甲基化的限制修饰天然免疫系统；而作为同样在细菌中广泛存在的CRISPR-Cas系统，则是一种获得性免疫。.依托本项目，按任务书和既定的研究目标组织优势力量攻关，主要完成了以下研究：.1.以Salmonella enterica serovar Cerro 87为细菌模型，揭示了其内源DNA磷硫酰化修饰系统新的序列特征和甲基硫化双修饰。.2.以Salmonella enterica serovar Cerro 87为细菌模型，揭示了由dndCDE-FGH组成的DNA磷硫酰化修饰-限制系统与CRISPR-Cas9免疫系统的兼容性。当两套系统共存时，能够指数级的提高宿主对噬菌体的抗性。.3.通过将Dnd系统分为磷硫酰化修饰和介导磷硫酰化的修饰蛋白这两方面，揭示了Dnd系统对CRISPR-Cas9发挥免疫作用的干扰。.4.通过将Dnd系统分为磷硫酰化修饰、介导磷硫酰化修饰的修饰蛋白以及其所发挥的限制作用这三方面，全面探究了Dnd系统对CRISPR-Cas系统在以外源DNA为底物获取spacer过程中的影响。首次揭示了与CRISPR-Cas共存的限制系统能够抑制其以外源DNA为底物获取spacer的功能。.至此圆满完成了本项目的研究内容和目标，并依托本项目发表SCI论文六篇。项目成果揭示了微生物中共存的多种防御系统间复杂的相互关系，为理解自然界中广泛存在的多层级防御系统机制提供了新的视野，也为理解细菌与噬菌体之间的军备竞赛打下基础。