自噬应激对脊髓急性损伤和修复的影响及其调控机制的研究

The present study shows that after acute injury 1 hour the autophagy activity increase in spinal cord motoneurons. But there is no report about the role of this increase in acute spinal cord injury and repair. We found the oxygen ischemia induced autophagic stress in vitro culture of neurons, and 6 hours peak, meanwhile,the activity of histone acetylation enzyme 6 (HDAC6) significantly change. On the basis of hypothesis: acute injury can induced autophagic stress occurred in spinal cord motoneurons, and the stress state will be continue increasing to accelerate neuron degeneration and death； HDAC6 can regulate the autophagy-lysosome formation to reduce the degree of autophagic stress, so as to prevent neurons secondary death and promoting the repair. In order to test this hypothesis, we will application of the thoracic T8 clamp rat model and the primitive cell culture model of the fetal rat spinal cord to observe the change of autophagic stress in the different time points after acute spinal cord injury, and preliminary discussion the transformation conditions of autophagy flow. At the same time we use of the gene knockout minus, express technology in-depth study the role of HDAC6 in autophagy-lysosome formation. This study aims to reveal the mechanism of autophagic strss in acute spinal cord injury and repair，and takes HDAC6 as the breakthrough point, looking for effective autophagic stress control targets. By this study we try to find effective intervation targets of autophagy which will contribute to provide an important theoretical basis for developping new drugs and proposing new therapeutic strategies to acute spinal cord injury.

目前研究表明，急性损伤后1小时脊髓前角运动神经元内自噬活性上调。但此种上调在急性脊髓损伤及修复中的作用如何尚无报道。我们前期发现缺血缺氧会诱导体外培养的神经元内发生自噬应激，且6小时达高峰，同时组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的活性显著改变。据此提出假说：急性损伤可诱导脊髓神经元内发生自噬应激，此种应激状态会持续增高加速神经元的变性及死亡，HDAC6可通过调控自噬溶酶体的形成减轻应激程度，从而阻止神经元继发性死亡并促进其修复。为验证这一假说，我们通过大鼠胸椎T8部分钳夹模型及胎鼠脊髓原代细胞培养模型，观察不同时间点自噬应激程度的变化，并初步探讨其向保护性自噬流转化的可能条件；同时利用基因敲减及过表达技术深入研究HDAC6调控自噬的分子机制。本研究旨在揭示自噬应激对脊髓急性损伤及修复的影响，以HDAC6 为切入点，寻找有效的自噬调控靶点，为探索脊髓损伤病理过程和新的治疗靶点奠定基础。

研究背景：目前研究表明，急性损伤后1小时脊髓前角运动神经元内自噬活性上调。但此种上调在急性脊髓损伤及修复中的作用如何尚无报道。我们前期发现缺血缺氧会诱导体外培养的神经元内发生自噬应激，且6小时达高峰，同时组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的活性显著改变。.重要结果和关键数据：1、在此基础上我们利用胸椎T8部分钳夹SD大鼠和C57BL/6J小鼠脊髓半切模型研究发现急性损伤后24小时可诱导脊髓前角自噬标志蛋白LC3表达显著增高，且在受损的脊髓节段内大量神经元发生凋亡，同时残存的神经元内HDAC6表达增加，说明急性损伤所继发的凋亡与自噬有密切关系，HDAC6在残存神经元内表达增加很可能起到一定保护作用。2、各种机械损伤可导脊髓发生缺血缺氧，此种病理变化又可以继发脊髓的二次损伤，导致不可逆的神经退行性改变。为了模仿此种病理状态，我们利用缺血缺氧条件处理原代神经元和胶质细胞共培养模型以及类神经元细胞（PC12），结果发现细胞内HDAC6表达增加且其定位发生明显改变，由散在细胞质周围聚集到细胞核两端，同时细胞内氧自由基（ROS）聚集且快速活化并稳定HIF-1-alpha蛋白，促发了氧化应激现象。3、更有趣的是，我们还意外发现细胞内分子伴侣介导的自噬途径（CMA）活性发生改变。4、为了明确机制，我们通过RNA干扰技术（siRNA）抑制HDAC6后，发现细胞在缺血缺氧条件下氧化应激进一步加剧且细胞凋亡增加。5、深入研究揭示了由于HDAC6活性下降，细胞内CMA途径被阻断，不能有效补偿缺血缺氧条件下细胞内大自噬降解途径的无效性，从而导致自噬应激的发生，减弱了细胞抵抗氧化应激的能力，最终继发自噬性死亡和凋亡。6、此外，在脊髓损伤患者的血液和脑脊液中也发现HDAC6表达增加，可持续到脊髓损伤后1-2周。.科学意义：急性损伤可诱导脊髓神经元内发生自噬应激，此种应激状态会持续增高加速神经元的变性及死亡，HDAC6可通过调控CMA途径有效补偿大自噬途径的无效性，从而减轻自噬应激程度，阻止神经元继发性死亡并促进其修复。我们的研究揭示自噬应激对脊髓急性损伤及修复的影响，以HDAC6 为切入点，寻找有效的自噬调控靶点，为探索脊髓损伤病理过程和新的治疗靶点奠定了理论基础。