IL-35-Treg 细胞的分化发育及功能学研究

Treg activation and functional specialization play critical role in immune self-tolerance. The immunosuppressive cytokines TGF-beta, IL-10 and IL-35 have been implicated in regulatory T cell function to suppress local immunity through a combination of bystander suppression and infectious tolerance. Our preliminary results demonstrated the IL-35 secreting Treg (IL-35-Treg), was a distinct Treg lineage from the Blimp-1 dependent IL-10 producing subset (Blimp-1-Treg). Here, we propose to determine the transcriptional regulation of IL-35-Treg by comparing the mRNA profiling of IL-35-Treg and Blimp-1-Treg, in combining with in vitro reporter screening, retrovirus based overexpresion, as well as CRISPR/Cas9 knockout experiment, we hope to elucidate the detailed molecular mechanism in controlling IL-35-Treg generation. This study will provide a better understanding of immunosuppressive mechanism of Treg, and might have important implications in both autoimmune pathogenesis and the tumor therapy.

调节性T细胞（Treg）活化分化过程对维持自身免疫稳态至关重要，效应性Treg可分泌IL-10、IL-35等可溶性抑制性细胞因子，行使区域免疫抑制功能。我们的前期结果显示分泌IL-35的IL-35-Treg和分泌IL-10的Blimp1-Treg是两群完全独立的效应性Treg亚群，在机体免疫耐受中可能发挥不同的作用。目前IL-35-Treg的分化发育并不清楚，本项目拟利用已构建的35EbiT-Blimp1-GFP双报告基因小鼠，通过转录组测序分析比较这两群效应性Treg在转录水平的差异，获得IL-35-Treg的特异性转录谱，结合转录因子筛选、体外过表达和CRISPR/Cas9技术，揭示IL-35-Treg 的分化发育规律，探索IL-35-Treg和Blimp1-Treg的免疫学功能。该研究将深化我们对Treg免疫抑制机制的认识，可能为多种自身免疫疾病、感染性疾病及癌症等提供新的治疗策略。

本项目利用BAC转基因技术构建了IL-35的报告基因小鼠（Ebi3-Dre-Thy1.1小鼠，简称35EbiT），在该小鼠中可以用细胞表面Thy1.1的表达来指示细胞内Ebi3亦即IL-35的分泌情况，并可以通过注射Thy1.1抗体在体内研究IL-35产生细胞的功能。通过报告基因的标记，我们发现，在小鼠体内存在的IL-35分泌细胞主要来源于tTreg细胞；IL-35-Treg表现出效应性Treg细胞的表型，并且在控制肿瘤免疫和肠道免疫反应中发挥重要功能；Foxp3可以促进Treg细胞分泌更多的IL-35细胞因子并且这个过程不依赖Blimp1的表达。进一步通过表面分子和转录谱分析发现，分泌IL-35的IL-35-Treg和分泌IL-10的Blimp1+Treg是两群相对独立的效应性Treg亚群，它们具有不同的表面标记和组织分布。其中，IL-35-Treg细胞高表达CCR7、Vcam1等分子，倾向于留在T细胞区域，可能抑制早期的T细胞活化；而Blimp1+Treg细胞分泌高水平IL-10和多种颗粒酶（Gzms），高表达多种趋化因子受体，倾向于迁移到外周免疫部位发生抑制功能；如果同时敲除这两种细胞小鼠则会罹患自发肠炎。证明IL-35-Treg和IL-10-Treg具有功能的互补性，共同合作维持机体的免疫耐受。此外，本项目利用35EbiT.Nr4a1-EGFP小鼠，发现分泌IL-35的Treg细胞会表达更高的Nr4a1，证明了IL-35的表达更依赖于TCR信号，TCR信号增强之后能增加CD4细胞和Treg细胞产生IL-35的能力。.本项目从表型和功能两方面揭示了不同效应性Treg细胞亚群（IL-35-Treg和IL-10-Treg），将丰富我们对Treg免疫抑制机制的认识，可能为多种自身免疫疾病、感染性疾病及癌症等提供新的治疗策略。