血小板中性粒细胞聚集体诱导中性粒细胞胞外诱捕网NETs形成的机制

Neutrophil extracellular traps (NETs) have been found capable of promoting deep vein thrombosis (DVT), so induced factors of NETs formation has become an important research direction. Our previous study has discovered the phenomenon of platelet-neutrophil aggregates (PNAs) was higher in the member of thrombosis than that of healthy people. In vitro experiments show that PNAs is related to NETs. Some articles prove the neutrophil-platelet interactions play important role in proinflammatory response and procoagulant state. So we suppose that the activation of platelet in PNAs can induce the precursor of NETs. The study is designed to analyze the signal pathway of NETs, the molecular mechanism of PNAs in regulating NETs formation and the DNA release of the neutrophil in PNAs by blocking the neutrophil-platelet interactions pathway(P-selectin/ PSGL-1 and GPIb/αMβ2) in both mice models and clinical studies. The work is expected to reveal a novel role of platelets in the initiation and progression of DVT and provide potentially new ways for treatment of inflammatory and thrombosis diseases.

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）可促进深静脉血栓（DVT）形成，诱导NETs形成的因素是目前研究热点。申请人前期研究发现DVT患者外周血血小板中性粒细胞聚集体（PNAs）升高，体外实验证实PNAs与NETs形成显著相关。中性粒细胞与血小板之间相互作用是炎症和促凝的重要环节，推测PNAs上血小板活化诱导了NETs形成。为了详尽阐明这一过程，申请人拟以血小板和中性粒细胞上受体(P-selectin/ PSGL-1和GPIb/αMβ2)作为切入点，同时筛查血小板活化产物对NETs形成的作用。从 NETs 形成的信号通路、形成NETs时PNAs内中性粒细胞变化、胞外DNA释放过程等研究血小板与中性粒细胞间在生成NETs时相互作用。小鼠体内模型探讨PNAs诱导NETs形成的特点以及抗血小板药物对DVT抑制作用。研究成果将为明确血小板在调控NETs生成导致DVT的作用、为炎症与DVT治疗提供实验室依据

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)介导的杀菌途径是人体重要的固有免疫应答机制。组织中NETs的诱捕作用使机体有效防御病原体，但当缺乏有效抗衡调节时，它又能损伤组织，引起SLE、血管炎、深静脉血栓（Deep venous thromboembolism，DVT）等疾病。DVT是危害人类健康的一种常见多因素疾病，其发病机制是目前研究热点。有研究表明，血小板是NETs发展的重要促进成分，而血小板中性粒细胞聚集体（PNA）是联系止血和炎症过程的基本机制。目前尚无关于PNA与深静脉血栓形成（DVT）之间相关性的研究。本课题的主要研究内容是体外诱导形成PNAs，监测NETs表达过程；分析研究DVT患者外周血PNAs、NETs与血栓的量化关系。在NETs体外诱导实验中，抽提分离健康人中性粒细胞和富血小板血浆，加入低剂量PMA和ADP诱导剂，用游离DNA（cell-free DNA，cf-DNA）监测NETs形成情况。结果显示随着时间增加，PNAs和cf-DNA同步增加，表明PNAs与NETs间呈高度相关性，r2=0.972。在DVT患者的外周血象中发现，中性粒细胞比例增高，以急性期明显，慢性期轻度增高。有些典型患者同时伴有血小板减少，并且伴血栓的持续发生发展。即使长期服用华法林、肝素等抗凝药，外周血片仍可见中性粒细胞比例增高。镜检见中性粒细胞形态不规则，血小板黏附于中性粒细胞现象，提示DVT患者的血液中存在PNA。我们建立了实验室PNA的流式检测方法并对DVT患者外周血中的PNA和血小板活化水平进行定量检测。与对照组（中位数5.16％，IQR 2.40-9.60）相比，DVT组中PNA的水平显着增加（中位数8.43％，IQR 4.11％-15.69％，p <0.01）。DVT组的总血小板活化水平（中位数16.06％，IQR 6.04-22.05）也先显著高于正常对照组（中位数11.26％，IQR 5.54-19.99，p <0.05）。 PNAs水平与总血小板活化相关（r2 = 0.58，p <0.0001）。当PNA的水平高于7.4％时，DVT发生的机率较高（OR 3.60，95％CI 1.463-8.838，p <0.01）。综上所述，PNAs水平升高与DVT发生风险有关，将来可能可以作为预测DVT发展的一个合适标志