猪性原细胞向精原干细胞转化的分子机制及其体外长期增殖培养体系的建立

本项目拟以长白公猪的睾丸细胞为材料，利用免疫磁珠等方法分离纯化猪雄性生殖干细胞（male germline stem cells， MGSCs）；利用基因芯片检测1、6和9周龄公猪MGSCs表面分子标记THY1阳性细胞与阴性细胞的基因表达谱，对性原细胞和精原干细胞（spermatogonial stem cells， SSCs）的高表达基因及其差异表达基因进行GO分析、信号通路与调控网络分析和聚类分析，阐明性原细胞转化为SSCs的分子机理，揭示MGSCs的分子生物学特征，寻找其特异的分子标记，预测MGSCs的重要调节基因。同时，进一步研究血清、饲养层细胞和生长因子等对MGSCs体外增殖的影响，建立MGSCs体外长期增殖的培养体系。本项目研究将为猪MGSCs多潜能性及定向分化的表观遗传机制等研究奠定基础，为克隆和转基因猪制作提供新的途径和方法，也将为其它家畜和人MGSCs的研究提供理论参考。

本项目以长白公猪的睾丸组织为材料，利用RT-PCR和免疫组织化学染色等方法，成功地筛选到可以用于免疫磁珠和流式细胞分选的猪雄精原干细胞分子标记Thy1;比较了差异贴壁法、曲细精管培养法、Nycodenz密度梯度离心法以及免疫磁珠法等方法富集猪精原干细胞的效果，建立了结合差异贴壁、免疫磁珠法（MACS）和Nycodenz密度梯度离心法的分选方案，使猪精原干细胞的纯度能达到80%以上；利用qRT-PCR、 免疫组织化学染色、 Western Blotting、精原干细胞移植等技术手段鉴定分选或培养的猪精原干细胞; 系统地研究了血清浓度、饲养层细胞和不同生长因子等对猪精原干细胞体外增殖的影响，在此基础上，分离纯化后的精原干细胞先在含1%胎牛血清的基础培养基中培养，10天后将精原干细胞来源的克隆传代至猪支持细胞饲养层上继续培养，并添加5 ng/ml bFGF和10 ng/ml EGF，从而建立了猪精原干细胞的体外长期培养体系。目前，已经在生殖领域的国际知名学术期刊发表3篇关于本项目研究猪精原干细胞的学术论文。本项目研究成果为猪精原干细胞的相关研究奠定了基础，也可为克隆和转基因猪制作提供新的途径和方法，将为其它家畜和人精原干细胞的相关研究提供理论参考。