猪精原干细胞增殖与分化的表观修饰调节机理

The spermatogonial stem cells (SSCs) are rare in number and are easy to differentiate in vitro culture. The long-term culture system of porcine SSCs has not been developed yet as lettle information regarding the mechanisms of their self-renewal and differentiation is available. In this study, DNA and histone methylation of SSCs and differentiated germ cells in Landrace pigs will be observed by immunochemistry. Using RNAi, MeDIP-Seg, ChIP-Seg, luciferase reporter system, SSCs transplantation and bioinformatic analysis, the effects of DNA methylation and histone methylation on SSCs self-renewal and differentiation will be analyzed. The DNA methylases, histone methylases and demethylases that regulate SSCs self-renewal and differentiation will be screened. The microRNAs that regulate the aforementioned enzymes during the prosess will be studied. The results of this study will be helpful for developing a long-term culture system and for further study of SSCs biology.

猪精原干细胞（Spermatogonial stem cell, SSCs）在睾丸中数量少，在体外培养条件下易分化，尚未建立其体外增殖的长期培养体系。其主要原因是精原干细胞增殖与分化的分子机理尚不清楚。本研究拟以长白猪睾丸为材料，利用免疫组织化学染色检测精原干细胞及分化的生精细胞中DNA和组蛋白的甲基化修饰。利用RNA干扰、甲基化DNA免疫沉淀-高通量测序和染色质免疫共沉淀-高通量测序、荧光素酶报告系统以及精原干细胞移植等技术，研究DNA和组蛋白甲基化修饰对猪精原干细胞增殖与分化的影响；探索对猪精原干细胞增殖与分化具有重要作用的DNA及组蛋白甲基化修饰酶；研究microRNA在DNA及组蛋白甲基化修饰调控过程中的作用。本研究结果对于建立猪精原干细胞体外长期培养体系、深入研究猪精原干细胞的生物学特性具有重要意义。

精原干细胞(SSCs)可将遗传信息传递到子代，是睾丸中最重要的一类成体干细胞，已成为目前生殖生物学与再生医学的热点。而在哺乳动物中组蛋白甲基化可与其他表观修饰相互作用，从而发挥其功能。且组蛋白甲基化与染色质的异质化有关，在精子发生过程中发挥重要作用。为此，本项目研究了H3K4me1/2/3、H3K27me1/2/3、H4K20me1/2/3 的动态分布，建立了其在猪精子发生过程中的动态变化谱。研究了组蛋白甲基转移酶ESET在猪精原干细胞存活中的功能及其作用机制。ESET随着年龄的增加在猪睾丸中的表达逐渐增多，而H3K9me3的表达量在精原干细胞中最多，说明H3K9的甲基化状态可能与猪精原干细胞的维持相关。结果显示，敲低ESET可诱导精原干细胞出现凋亡现象，且凋亡的发生不依赖与H3K9me3。ESET可与催化H3K27甲基化的甲基转移酶EZH2结合，且ESET敲低引起H3K27me3水平降低，说明ESET干扰调控精原干细胞凋亡是通过H3K27me3水平调控的。同时，为了验证ESET在进化上的功能保守性，研究了ESET在小鼠精原干细胞中发挥的作用。结果显示，与猪的研究上相似的是ESET 在小鼠睾丸组织中高表达，ESET敲低阻碍了精子的正常发生；且ESET敲低也可引起精原干细胞发生凋亡。而与猪研究中不同的是ESET干扰引起的凋亡是通过调控Cox4i2基因DNA甲基化水平及其表达来调控凋亡发生。另外，在PTEN/AKT/FOXO1参与的细胞凋亡机制中，ESET与AKT相互结合，并参与AKT对下游靶蛋白及靶基因的调控。ESET还可以通过H3K9me3修饰直接调控凋亡通路中特定基因的转录活性。由于，H3K9me3与DNA甲基化修饰均可参与异染色质的形成，且H3K9甲基化与DNA甲基化可协同作用调控基因表达，因此，研究了DNA甲基化转移酶在睾丸发育中的动态表达谱。发现在睾丸组织发育过程中Dnmts呈现明显的动态表达模式，其表达水平随着发育的进行而发生变化。总之，本项目首次在表观遗传学水平研究了组蛋白甲基化修饰及甲基化酶在精原干细胞中的功能及其调控机制。这为后续猪精原干细胞的表观修饰调控奠定了基础，也为以后对精原干细胞的表观调控机制研究提供了理论参考。