组蛋白甲基化酶SETDB1对猪精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究

Spermatogonial stem cells (SSCs) can be differentiated into sperm, and also transformed to pluripotent cells or directly induced to other cell types. The mechanisms governing SSC proliferation and differentiation remains unclear, which has been a constraint for the study and application of SSCs. Histone methyltransferase SETDB1 plays roles in regulation of proliferation and differentiation in embryonic stem cells and adult stem cells. However, its roles in SSCs remain obscure. In this proposal, the roles that SETDB1 plays in proliferation and differentiation of SSCs will be analyzed by CRISPR/Cas9 mediated SETDB1 knockout and lentiviral vector mediated overexpression of SETDB1. The mRNA profile of porcine SSCs regulated by SETDB1 will be revealed by ChIP-seq, RNA-seq and bioinformatics analysis. The epigenetic mechanisms of how SETDB1 modulates SSC proliferation and differentiation will be elucidated using RNAi, IP, Co-IP, BiFC, ChIP. The findings of this proposal will be helpful for further development of long-term culture system of porcine SSCs, and will provide a novel strategy for generating transgenic pigs, and will afford information for the study of SSCs in the other species and iPS cells as well.

精原干细胞既能分化产生精子，又能转化为多能干细胞，还能直接诱导为其它类型的细胞。但精原干细胞增殖与分化的机理尚不清楚，制约了其研究与应用。组蛋白甲基化酶SETDB1参与调控胚胎干细胞及成体干细胞的增殖与分化，但在精原干细胞中的作用及其调控机制尚不清楚。本项目拟以猪精原干细胞为材料，利用CRISPR/Cas9敲除和慢病毒载体超表达SETDB1基因，研究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用；结合ChIP-seq、转录组测序和生物信息学分析，建立精原干细胞中受SETDB1调控的基因表达谱；利用RNAi、IP、CoIP、BiFC、ChIP等方法探究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的表观调控机制。本项目研究结果将为猪精原干细胞体外长期培养体系的成功建立提供依据，为转基因猪的制备提供新的途径，也将为其他家畜精原干细胞以及iPS细胞的相关研究提供理论参考。

精原干细胞（SSC）既能分化产生精子，又能转化为多能干细胞，还能诱导为其它类型细胞。但SSC增殖与分化的机理尚不清楚，制约了其研究与应用。SETDB1参与调控胚胎干细胞及成体干细胞的增殖与分化，但在SSC中的作用及其调控机制尚不清楚。.项目组圆满完成了项目预期目标，并取得了如下研究成果：.(1) 通过ChIP-seq和WGBS测序，建立了精子发生过程中全基因组H3K9me3和DNA甲基化动态修饰图谱。通过ATAC-seq，ChIP-seq和RNA-seq分析了猪SSC分化过程中的SETDB1、H3K9me3修饰以及染色质可及性变化。.(2) 发现SETDB1通过调控活性氧水平，从而调控SSC的存活。在SSC中SETDB1的缺失会激活活性氧下游p38/JNK-FOXO4信号通路，引发FOXO4活化。此外，在分化精原细胞中SETDB1的缺失会导致DNA损伤敏感性增加。.(3) 在猪SSC自我更新与分化过程中，SETDB1通过调控染色质可及性变化，引起细胞黏附与分化相关基因表达改变，从而调控SSC的归巢与分化。.(4) 发现YTHDF2调控Setdb1的表达，且它们均参与到DNA损伤应答反应，并进一步证实YTHDF2敲除诱导的分化精原细胞DNA损伤敏感性增加是SETDB1下调导致的。.(5) 基于单细胞测序手段，解析了猪精原细胞的异质性、亚群分类及其差异基因的表达情况。鉴定了猪SSC的新标记物SSEA4，并由此建立了高效分选猪SSC的新方法。.(6) 培养出两种具有猪SSC属性的永生化细胞系，建立了基于纳米材料G5-cRGD高效转染原代SSC的技术体系。.(7) 利用Hi-C、ChIP-seq和RNA-seq等技术，探究了猪SSC和分化精原细胞的染色质三维空间结构，阐明了猪SSC分化过程的高级染色质动态变化。发现猪SSC分化伴随着染色质高级结构减弱，直至减数分裂阶段染色质高级结构消失，从三维基因组层面证实了精原细胞分化的实质是为进入减数分裂做准备；发现猪SSC分化过程中染色质高级结构A/B区室和TAD与基因的动态表达相关。此外，在5kb分辨率下解析了PEI对基因表达的调控机制，鉴定出了猪SSC分化过程中受PEI调控的重要基因。.本项目研究结果将为猪SSC体外长期培养体系的建立提供依据，为转基因猪的制备提供新的途径，也将为其他家畜SSC以及成体干细胞的相关研究提供理论参考。