生物法多糖结合疫苗的精确提呈设计和尺寸优化

Polysaccharide conjugate vaccines have good Immune effects, resulting in huge social and economic benefits. Our preliminary works have established a new synthetic biology method for conjugate vaccine production: covalently attaching the bacterial O-antigen polysaccharide to a carrier protein in vivo with the help of Neisseria Meningitidis protein O-linked glycosylation system and having found out and optimized the recognition motif of this O-linked glycosylation system using molecular biology method. So on the basis of previous work, we could design new vaccines using the optimal motif for further improvement. It can be fused with T-cell epitopes (5-6 candidates) to optimize polysaccharide presenting efficiency. On the other hand, a multimerization domain (2-3 candidates) can be added into the sequence of carrier protein to increase particle size of the new vaccine. The immunological evaluation of each kind of polysaccharide-protein products will be performed in this study. And the best one of candidates from different groups will be further combined to complete the precise design of novel polysaccharide conjugate vaccine. This new vaccine design ideas presented here can be used to develop a variety of bacterial polysaccharide conjugate vaccines with better effect. This strategy is common and cutting-edge, and important for the prevention of infectious diseases.

多糖结合疫苗具有良好的免疫效果，产生了巨大的社会和经济效益。本研究前期工作建立了一种新的多糖结合疫苗生产策略：通过合成生物学方法，利用脑膜炎奈瑟氏菌蛋白质O-糖基化系统在细菌体内进行多糖与蛋白的偶联；成功解析并优化此系统的糖基化识别基序。本研究将在前期糖基化平台的基础上，利用最优基序进一步改进疫苗的设计：增加可与MHC-II结合的抗原提呈肽（5-6种候选），优化多糖提呈效率；增加多聚化结构域（2-3种候选），增加疫苗颗粒大小。本研究将对上述改造方式中产生的多糖-蛋白产物进行免疫评价，筛选每种改造方式中的最优方案，并进一步进行组合评估，完成新型多糖结合疫苗的精准设计与改造优化。本研究提出的新型疫苗设计思路，可设计出更为高效的多糖结合疫苗，并可用于研发各种病原菌多糖结合疫苗，具有通用性和前沿性，对细菌性传染病的感染预防具有重要意义。

多糖结合疫苗被认为是目前最成功的的细菌性疫苗，具有良好的免疫效果，产生了巨大的社会和经济效益。然而，目前传统的化学制备法成本高，产率低，价格昂贵，疫苗均一性差。本研究前期工作中建立了一种新的多糖结合疫苗生产策略：通过合成生物学方法，利用脑膜炎奈瑟氏菌蛋白质O-糖基化系统在细菌体内进行多糖与蛋白的偶联，并成功解析、优化此系统的糖基化识别基序。本研究在前期糖基化平台的基础上，利用最优基序进一步改进疫苗的设计，首先，在底物蛋白CTB的C末端的糖基化位点基序后分别连接12种可与MHC-II结合的抗原提呈肽，分析糖基化效率；之后，将原载体蛋白CTB与可形成三聚的结构域（Tri）进行融合表达，使其通过蛋白自组装形成纳米颗粒，并通过引入糖基化系统中实现纳米颗粒的糖基化，并对所得到的的糖蛋白颗粒尺寸以及理化性质进行表征；进一步，通过免疫小鼠评价疫苗安全性和保护效果，并对免疫机制进行初步的探索，同时探索不加佐剂时的免疫应答及保护性；最后，将纳米载体C末端糖基化位点基序区域替换为前期筛选的抗原肽，制备新的纳米多糖结合疫苗，并对免疫应答以及保护性的提升进行分析。结果发现，CTB的C末端融合12种不同抗原肽后7种可以实现糖基化；而将CTB与可形成三聚的短肽（Tri）融合表达后，能够形成约20nm的蛋白颗粒，引入糖基化系统后成功实现纳米蛋白糖基化，形成约30nm的糖蛋白颗粒，从而首次利用生物法制备了纳米级多糖结合疫苗；以5倍免疫剂量免疫小鼠后表现出很好的安全性；常规免疫小鼠后能够激发强烈的细胞免和体液免疫应答，在5倍半数致死剂量致病菌攻击下依然具有100%保护率；通过将原糖基化位点序列替换为可被MHC-II识别的短肽，发现当替换为P2时，免疫效果显著提升，可进一步开发为候选疫苗。本研究提出的新型疫苗设计思路，可设计出更为高效的多糖结合疫苗，并可用于研发各种病原菌多糖结合疫苗，具有通用性和前沿性，对细菌性传染病的感染预防具有重要意义。