高Hcy血症对脑出血后神经血管单元损伤及其机制的研究

Hyperhomocysteinemia has been proved to be an independence risk factor of cardiovascular and cerebrovascular diseases. Patients with intracerebral hemorrhage (ICH) accompanied by hyperhomocysteinemia tend to have a larger hematoma volume. The volume of hematoma was directly correlated with the prognosis of patients with ICH. Researches about injury effects on neurovascular unit of hyperhomocysteinemia and its mechanisms after ICH is unknown. Our research group has successfully established ICH models and hyperhomocysteinemia models using mice previously and we are planning to establish ICH models using mice with hyperhomocysteinemia to investigate effects of hyperhomocysteinemia on the behavior of ICH mice, hematoma absorption rate and cerebral edema volume. A variety of experimental techniques would be adopted including micro-optical sectioning tomography for research. Effects of hyperhomocysteinemia on neurovascular unit injury in acute phase and remodeling in recovery phase of ICH would be evaluated including apoptosis of neuron and endothelial cells, disruption of blood-brain barrier, cerebral blood flow and collateral circulation, neurovascular regeneration and synaptic connections.Underlying mechanisms would be evaluated focused on DNMT3b and miR-451/IL-6R/STAT3 signaling pathways. Our research would provide theoretical foundation for future pharmaceutical prophylaxis and treatment.

高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症已被认为是心脑血管疾病独立危险因素,合并高Hcy血症的脑出血患者其血肿体积往往更大，直接影响预后。目前高Hcy血症对神经血管单元的损伤及具体机制尚不明确。本课题组前期已成功建立小鼠脑出血模型及高Hcy血症模型，拟进一步对高Hcy血症的小鼠建立脑出血模型，明确高Hcy血症对小鼠的行为学、血肿吸收速度及水肿体积的影响，并采用多种实验手段尤其是先进的显微光学切片断层成像系统研究高Hcy血症对小鼠脑出血后急性期神经血管单元损伤、恢复期神经血管单元重塑的影响进行研究，包括神经元、内皮细胞凋亡、血脑屏障损伤、脑血流调节功能及侧支循环、神经元及内皮细胞新生、神经突触连接重塑。并围绕DNMT3b蛋白、miR-451/IL-6R/STAT3信号通路展开机制研究。本研究将未来的药物研发及治疗提供理论基础。

背景：HHcy加重ICH不良临床结局的作用机制尚不清楚。本研究旨在通过动物实验和细胞实验探究 Hcy 对 ICH 后突触可塑性的影响、明确Hcy 抑制突触可塑性的机制。.方法：蛋氨酸饲料喂养C57BL/6J小鼠，自体血构建 ICH 模型。实验动物分组为：HHcy + ICH，Ctrl + ICH ，HHcy + Vehicle，Ctrl + Vehicle。对小鼠行行为学实验评估神经功能缺损情况。显微光学切片断层成像行神经纤维重建，观察树突形态，评估神经元突起的复杂性变化。对鼠脑行定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学检测。western blot检测PSD95、synaptophysin 、CAMK2A 和磷酸化 CAMK2A 的表达。IF标记MAP-2、磷酸化 CAMK2A。行原代神经元培养，模拟 ICH 微环境并给予Hcy 处理。IF 标记 MAP-2，观察神经元突起的情况。IF 检测 CAMK2A 与磷酸化 CAMK2A 并采用慢病毒感染以改变 CAMK2A 的蛋白和磷酸化水平，联合体外微环境的模拟与 Hcy 处理后， IF 标记 MAP-2 以观察神经元突起。WB 实验检测神经元中 synaptophysin 的表达。.结果： HHcy 加重脑出血后神经缺损，神经元突起复杂程度明显减少。 PSD95、 synaptophysin 和 MAP-2 显著降低。体外模型中神经元细胞突起复杂性明显降低。HHcy + ICH 组中，与突触可塑性通路、谷氨酸结合通路和 AMPA 受体的激活通路等蛋白的磷酸化发生了明显变化。激酶-底物分析和信号组分析提示不同亚组之间的底物聚类为 5 个有相似磷酸化蛋白修饰的模块，其中模块 5 完全受 CAMK2A 激酶调控，对 CAMK2A 的底物位点磷酸化水平进一步分析，CAMK2A 底物在Ctrl + ICH 组显著升高，HHcy + ICH 组显著降低。Ctrl + ICH 组造模后 CAMK2A、 pCAMK2A 和 pCAMK2B的水平明显升高，HHcy + ICH 组的该蛋白水平明显降低。进一步采用慢病毒感染激活 CAMK2A 的活性，可逆转 Hcy 抑制 ICH 后神经元突起生长及突触可塑性蛋白表达的作用。.结论： Hcy 可能通过影响 CAMK2A 的活性，降低所调控的底物的磷酸化水平从而抑制 ICH 后的突触可塑性。