不同氮效率油菜基于液泡膜质子泵的硝态氮再利用差异及机理

液泡大量贮存的硝态氮不能及时转入细胞质还原再利用，是造成植物大量累积硝态氮和氮素利用效率不能进一步提高的主要原因。本项目以氮高效和氮低效油菜基因型为研究对象，在正常供氮和缺氮条件下，采用无营养液成分的珍珠岩砂粒砂培试验。通过添加特异性抑制剂分别对液泡膜质子泵（H+-ATPase和H+-PPase）和硝酸还原酶（NR）活性进行专性调控，同时测定叶片液泡膜质子泵和NR活性，及活化状态NRA（NRAact）和总NRA（NRAmax）的变化,并通过双阻离子选择性微电极法测定液泡和细胞质中硝态氮浓度。研究液泡膜质子泵活性变化对液泡硝态氮再转运的影响，分析液泡膜两质子泵对液泡硝态氮再利用及氮素利用效率的贡献率，探明NR和NRAact以及NRAmax对液泡膜质子泵活性和液泡硝态氮再转运的影响，比较以上指标的基因型差异和对氮水平的响应。进一步揭示液泡膜质子泵再转运液泡硝态氮的机理及其与氮素利用效率的关系。

本项目以前期筛选到的氮高效和低效油菜基因型为研究对象，在土培、砂培和水培条件下，采用了液泡膜质子泵活性的专性抑制剂处理，以及生理和分子生物学手段，揭示了油菜液泡膜NO3-转运系统对液泡NO3-短途分配的调控机理。研究结果表明，抑制剂处理可以显著抑制油菜液泡膜质子泵（V-PPase，V-ATPase）的活性，降低植物吸收的NO3-向液泡中的累积能力，更多的NO3-留存于细胞质中，从而诱导原生质体中液泡外硝酸还原酶（NR）的活性；此外，参与NO3-代谢的氮代谢关键酶主要存在于细胞质中，因此，有更多的NO3-储存于细胞质中加速了NO3-的代谢，从而降低了植物组织中NO3-的含量。相关性分析结果同样表明，液泡膜质子泵的活性与NR活性有着显著地负相关性，而与植物组织中NO3-的含量有显著地正相关性；V-PPase对于这种相关性的调控能力强于V-ATPase，表明V-PPase在液泡膜NO3-的短途分配中起到更重要的作用。在上述研究的基础上，进一步解析了油菜液泡膜质子泵调控NO3-短途分配的机理，研究结果表明：氮高效基因型植株体内氮含量显著低于氮低效基因型，而两基因型的总氮吸收量没有显著差异；氮高效油菜基因型液泡膜质子泵主效基因的相对表达量显著低于氮低效基因型，从而导致氮高效基因型的液泡膜质子泵酶的活性也显著低于氮低效基因型，进而氮高效基因型有更多的H+从液泡中排出，并显著减少了液泡NO3-的累积。由此可见，氮高效基因型液泡膜质子泵的活性显著低于氮低效基因型是氮高效基因型植株体内有更低的NO3-含量和更高的NUE的主要原因之一。 . 通过NR活性的专性抑制剂处理, 研究NR活性和硝酸盐含量的基因型差异。结果表明, NR专性抑制剂处理可以显著降低叶片NR活性, 但对叶片硝酸盐的含量没有显著影响, 一定程度的NR活性变化对植株体内硝酸盐的含量并没有显著的影响。此外，为了更进一步的揭示分配到液泡外原生质体中NO3-的代谢机理，项目采用15N标记和氮代谢关键酶（PE、GS、GOGAT）活性抑制剂的方法，研究了油菜N素的再利用机理，研究结果表明：PE、GS、GOGAT都是植株生长后期氮素再利用调节的关键代谢酶，油菜的籽粒产量和NUE都明显受到这些酶活性的正调控。