结核分枝杆菌耐喹喏酮药物的泵机制研究

结核病危害严重，而结核病耐药现象是引起目前全球结核病急剧上升的重要原因，成为全球日趋严重的新问题。药物泵通常会引起结核分枝杆菌产生低水平的固有耐药现象，也是造成耐药突变和高水平耐药现象的一个原因基础。我们近两年的研究表明，结核分枝杆菌对喹喏酮类药物的耐药现象除了由相关位点的突变引起外，另一重要原因是存在喹喏酮类药物泵，并且是无突变耐药菌耐药的主要原因，使用喹喏酮类药物泵抑制剂后会引起最低抑菌浓度（MIC）的显著变化。为了进一步明确结核分枝杆菌存在的喹喏酮类药物泵的耐药机理，本研究将分析喹喏酮药物泵与耐药突变产生之间的关系，明确结核分枝杆菌的喹喏酮类药物泵相关基因及其药物诱导下的表达变化水平，通过过表达或敲除泵基因以及构建泵蛋白胞内段突变蛋白体库的方法来研究结核分枝杆菌耐受喹喏酮药物的泵作用机理，为耐药结核病的防治出现奠定基础。

结核病，尤其是耐药结核病严重威胁人类健康，开展对结核病耐药机理的研究是结核病防治的工作的重要基础性工作。本研究主要从结核分枝杆菌耐药的药物泵出菌体的机制进行研究，通过使用泵抑制剂和明确参与喹诺酮类药物外排作用的泵蛋白，明确泵蛋白在结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药性产生方面所起的作用。三种泵抑制剂对H37Rv防突变浓度（MPC）值均无影响。使用泵抑制剂后结核分枝杆菌耐药突变菌株的产生倾向于是对已有极少数耐药突变菌的“筛选”的结果。在不同抑制剂作用下，不同耐药类型（XDR、MDR和敏感菌株S）表现相同的MIC变化规律，即XDR菌株的MIC变化最大，其次是MDR菌株，敏感菌株受泵抑制剂的影响最小。进一步分析了具有不同耐药程度的菌株受泵抑制剂的影响。结果发现：泵抑制剂对耐药程度高的菌株（MIC>=16 mg/L）的外排泵的抑制作用强；其次是MIC为4和8 mg/L的菌株；MIC<=2的菌株受抑制的作用最弱。随着结核分枝杆菌进化产生出耐药性，由敏感菌演变为MDR菌，进一步成为XDR菌，药物泵的药物泵出作用也得到进化加强。对12个泵蛋白疑似基因进行定量PCR验证发现 ，Rv1250和Rv2936存在明显的变化,其它发生显著变化的还有Rv1819、Rv1272和Rv2846。根据结核分枝杆菌的耐药性演变规律，我们探索了使用INH高剂量治疗结核病的效果，发现高剂量治疗组较对照组在治疗成功率方面有所提高，实验组加大INH的使用剂量后，病人的脱落率并没有因为副反应加大而增加。利用spoligotyping方法，泵抑制试验用菌株的分型结果显示：试验菌株分为11个型，其中北京基因型展绝大多数（89株，87.25%），其它的非北京基因型菌株包括多种型，有T1、T2、T5、H1和MANU2。利血平和维拉帕米在北京基因型菌株中抑制作用较大，CCCP在北京基因型和非北京基因型中作用无差别