自噬在年龄相关性黄斑变性发生发展中的作用机制研究

Autophagy plays a significant role in maintaining cellular homeostasis and it is one of the major mechanisms for clearing aging organelles and oxidative damage.Its function decreases with age.Studies found that autophagy played an important role in aging,neurogenerative diseases,immune and inflammatory infection.Age-related macular degeneration actually is a multifactorial neurodegenerative disease associated with aging. Inflammasome is closely related to its onset. Retinal pigment epithelium(RPE) oxidative damage play a crucial role in the development of AMD.Several studies have verified the expression of autophagy protein LC3 in tha aging retina,especially in the RPE layer and photoreceptor cells;autophagy dysfunction related with the development of AMD,however, the regulation mechanisms between autohphagy and AMD is unclear.Our previous study validated that LC3 was elevated after oxidative stress in RPE.RPE cell lines,primary RPE,dry and wet AMD models were used in this study.Autophagy inducer/inhibitor,gene overexpression/gene konck down method were used to study the behavior changes of RPE；the alteration of pro-/anti-angiogenesis factors, mitochondrial damage,inflammasome and autophagy pathway were evaluated to identify the relationship between autophagy and AMD.This study will provide a basis for the pathogenesis anf prevention of AMD.

自噬对维持细胞稳态意义重大，是清除衰老细胞器和氧化损伤的主要机制之一。其功能随年龄增长而减弱。研究发现自噬在衰老、神经退行性疾病、免疫和炎症感染中具有重要作用，而年龄相关性黄斑变性（AMD）本质是一种与衰老相关的多因素神经退行性疾病。炎症小体与其发病密切相关。视网膜色素上皮细胞（RPE）的氧化损伤在其发生发展中也具有关键作用。研究证实自噬蛋白LC3表达于衰老的视网膜尤其是RPE和感光细胞中；自噬功能障碍与AMD发生发展有关，但其调控AMD的机制未明。本课题预实验发现，RPE氧化损伤时LC3-II集聚增加。本课题拟利用RPE细胞系、原代RPE细胞以及干性和湿性AMD动物模型，通过自噬诱导剂/抑制剂、基因过表达/敲减方法，围绕线粒体损伤、炎症小体、血管生成促进/抑制因子表达、自噬相关信号通路及RPE细胞功能变化，明确自噬与AMD发生发展的时相关系，为AMD的发病机制及其作用靶点研究提供依据。

自噬对维持细胞稳态意义重大，是清除衰老细胞器和养护损伤的主要机制之一。本课题围绕自噬开展了三部分研究。第一部分探讨自噬对A2E诱导的 RPE 细胞损伤和炎症反应是否具有保护作用，并从自噬的角度研究其与AMD发病相关的分子机制。结果显示脂褐素成分A2E能够抑制RPE细胞的增殖活性，刺激细胞炎症因子和血管生成因子的分泌；A2E 刺激下，能够诱导 RPE 细胞发生自噬反应；3-MA通过抑制A2E引起的自噬反应，加重了RPE细胞的损伤、炎症因子和新生血管因子的分泌;雷帕霉素通过抑制AKT/mTOR信号通路来激活自噬，一定程度上减轻了A2E造成的细胞损伤和炎症反应。早期激活自噬能够降低A2E对RPE细胞的损伤作用，起到了保护作用。第二部分体内构建蓝光诱导老龄C57小鼠光氧化损伤模型，体外蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞光氧化损伤模型,探讨自噬对光氧化损伤中的作用。结果显示蓝光可以诱导老龄C57小鼠视网膜急性光损伤，自噬和内质网应激在C57 小鼠蓝光损伤早期表达上调并协同发挥了抗损伤的作用，促进了C57小鼠视网膜功能修复。RPE细胞蓝光氧化损伤后期自噬流再次升高、内质网应激反应加剧，这提示氧化损伤后期可能存在别的参与调节机制。 第三部分从体内（激光诱导CNV模型）、体外试验（人原代视网膜血管内皮细胞）研究自噬相关基因EVA1A在AMD中的作用机制。结果显示，自噬相关基因-EVA1A 基因过表达减少CNV模型的渗漏；其作用机制在于不影响 VEGF 的表达，通过影响自噬相关因子的和促/抑血管生成因子的表达，来抑制CNV的形成。本项目围绕上述三部分研究，阐述了自噬在AMD发生发展中的作用，并为探索EVA1A的干预策略奠定了基础。