黄瓜心皮数基因CsCLAVATA3的启动子功能分析

The carpel number of cucumber fruit is of significant important for increasing fruit weight and improving commodity traits. Our previous studies have shown that carpel number variation in cucumber is controlled by a single gene, Cn, and linkage and association analysis revealed CsCLAVATA3 as the candidate gene of the Cn locus. A single-nucleotide mutation of upstream 1074 bp from the translation initiation site, was associated with Cn. The structure of CsCLAVATA3 gene is very different from the CLAVATA3 gene in Arabidopsis thaliana. In order to explain the connection between the single-nucleotide mutation and CsCLAVATA3, the promoter of CsCLAVATA3 was cloned, and a series of constructs with 5' deletions of the CsCLAVATA3 promoter vector will be employed. By genetic transformation of cucumber and GUS expression of cucumber organs, the core region of CsCLAVATA3 promoter will be scanned. We will predict and analyze the structure and features of the core region and verify the transcription factor binding with single-nucleotide mutation by EMSA-electrophoretic mobility shift assay. Summary, we will analyze the biological function of the CsCLAVATA3 promoter and elucidate the mechanism of the single-nucleotide mutation regulating the activity of CsCLAVATA3 gene. We will also provide the theoretical basis for the variation of Cn caused by the single-nucleotide mutation, and we will solidify a foundation for the cucumber carpel number regulating mechanism and molecular assisted selection breeding.

黄瓜心皮数对提高黄瓜果实单果重和改良商品性状具有重要意义。申请人前期研究表明，该性状是由CsCLAVATA3基因调控的简单质量性状，不同心皮黄瓜材料中该基因外显子序列相同，在翻译起始位点5’上游-1074bp的单碱基突变与心皮数性状关联，且CsCLAVATA3基因与拟南芥CLAVATA3基因结构差异较大。为了进一步解析该突变位点调控黄瓜心皮数的机理，本研究拟克隆CsCLAVATA3启动子序列，构建启动子GUS融合载体，设计一系列5’端缺失删减实验，在黄瓜中进行遗传转化，并通过 GUS 染色和RT-qPCR表达量检测获得启动子核心序列，分析核心序列的结构与特征。之后，通过凝胶迁移实验验证突变位点结合的转录因子，阐明CsCLAVATA3基因启动子的生物学功能，揭示突变位点对CsCLAVATA3启动子活性和基因表达的影响，为单碱基突变导致心皮数发生变化提供理论依据。

黄瓜心皮数对提高黄瓜果实单果重和改良商品性状具有重要意义。本研究团队根据研究目标等开展了心皮数基因CsCLAVATA3的启动子克隆及结构功能分析，克隆了5心皮和3心皮黄瓜转录起始位点上游2500bp启动子序列，单碱基突变位点位于TATA-box顺式作用元件上，GUS染色结果表明，CK和35S均表现正常，5心皮和3心皮的GUS染色结果差异不显著；基于CRISPR/Cas9基因编辑开展了CsCLAVATA3功能验证研究，构建了多个CRISPR/Cas9-CsCLAVATA3敲除载体，获得了五心皮突变体和扁茎突变体，通过转录组测序揭示了2个突变体影响的基因通路；开展了黄瓜CLE基因家族全基因组鉴定及表达分析，共鉴定出26个黄瓜CLE基因，使用已公开发表的转录组数据分析了23种不同黄瓜组织的基因表达情况， CsCLE9、10、18、22在多个样品中均高表达，表明它们在多个发育过程中起着重要的作用。通过'9930'中的qPCR分析，CsCLE基因在生长点、茎和花等组织中表达相对较高，而在根中表达较低；利用近等基因系开展了心皮数调控果实多效性研究，5心皮比3心皮果实平均重20%左右，成熟种子数量多120%左右；进行了5心皮黄瓜种质资源的分布及果实主要性状分析，该类种质主要分布于我国西双版纳地区的哈尼族等少数民族聚居地，果形普遍较大。项目从5心皮黄瓜种质的分布、启动子活性、基因功能及多效性等方面系统开展了研究，阐明了黄瓜心皮数基因CsCLAVATA3的功能及调控机制，为5心皮种质的开发利用奠定了理论基础。.项目执行期间共发表论文3篇，其中SCI论文2篇，北大中文核心1篇，共培养硕士2名，博士1名。以本项目为基础，项目主持人先后获批了山西省优秀青年基金项目支持，获批了山西省“三晋英才”称号，入选了山西农业大学青年拔尖创新人才支持计划，入选了山西农业大学“晋农新秀”。