斑蝥素对鳞翅目昆虫毒杀机理研究

食品安全及环境保护亟需新型生物源农药的研发。前期研究结果表明，昆虫天然产物斑蝥素对鳞翅目害虫有不同于现行多数杀虫剂的毒理学现象，具有程序性死亡特征。本项目拟利用分子生物学技术、流式细胞技术、透射电镜技术等分别检测斑蝥素对供试昆虫细胞生命活动有关关键酶PP2A的活性，PP2A及其下游相关基因的表达、线粒体膜透性、线粒体膜结构等指标影响，建立响应剂量/反应模型，分析临界时间和临界剂量，确定对测定指标影响的先后顺序和程度，进而明确斑蝥素对鳞翅目昆虫致毒作用的最初靶标是"酶"（线粒体前阶段）还是"膜"（线粒体阶段），明确该天然产物对鳞翅目昆虫与众不同的毒杀机理，为进一步合理开发利用斑蝥素提供科学依据。

摘要.以草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞株Sf9为实验材料，采用流式细胞技术、激光共聚焦技术、荧光显微技术、电镜技术等分别从斑蝥素（CTD）亚致死剂量对鳞翅目昆虫细胞的致死方式、对细胞膜的影响、对细胞核结构和染色质的影响、对细胞内磷酸酶活性的影响、对细胞线粒体形态及功能的影响，以及斑蝥素诱导Sf9细胞凋亡线粒体途径相关因子变化等方面进行了研究，结果表明：（1）CTD对Sf9细胞短期内（1.5h）即可产生抑制作用，细胞中毒以凋亡和坏死两种形式死亡。CTD抑制细胞增殖的主要方式是引起细胞发生早期凋亡。（2）CTD处理细胞后，导致细胞膜的离子通透性瞬间变化，但并未破坏细胞膜结构。先期对Na+、K+-ATPase 活性产生抑制，之后，对Ca2+-ATPase酶活性产生抑制。细胞膜透性改变及相关酶活性被抑制是CTD诱导细胞凋亡的先期事件。（3）斑蝥素处理Sf9细胞不影响细胞核结构。随着毒力作用，陆续染色质由均匀分布于细胞核内逐渐呈现出凝结、细胞染色质出现固缩并出现核边缘化现象。同时，细胞质中凋亡小体增多，呈现明显的凋亡细胞染色特征。（4）CTD可显著抑制Sf9细胞的PPP和PP2A酶活性，处理6h之后，与对照达极显著差异，最高抑制率为77.872%。（5）CTD处理Sf9细胞后对线粒体结构早期不产生破坏，但导致线粒体膜电位60min开始不可逆下降，线粒体脱氢酶活性在1.5 h后开始受到显著抑制，并且不断持续不可逆下降。膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）3h后通透性极显著增强，此时，荧光探针技术观察到线粒体出现溶解现象。（6）cytc、心磷脂、ROS等指标测定证明，CTD处理Sf9细胞后能迅速导致cytc过量释放，45 min开始已极显著高于CK。随后，细胞线粒体凋亡的关键酶系caspase3,8,9三种酶活力24h均被激活并显著上升，细胞进入程序性死亡。总之，斑蝥素对Sf9的致毒作用是快速侵入细胞，短时间导致线粒体膜透性提高、cytc过量释放，诱导细胞进入程序性死亡。这是一种全新的杀虫活性物质毒理机制。