长片段亚型NRF1在慢性砷暴露致皮肤损害中的保护作用及其机制的研究

Chronic exposure of human to inorganic arsenic(iAs) causes various dermal lesion, including hyperkeratosis and skin cancer,the underlying molecular mechanism is still unclear. Our previous studies revealed that chronic arsenic exposure causes malignant transformation in human keratinocytes and oxidative stress occurrs in response to iAs exposure may be one important factor in dermal arsenic toxicity. Nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor 1(NRF1) encodes several protein isoforms. Long isoforms of NRF1(L-NRF1s) play important roles in antioxidant response agaist acute iAs3+ exposure-induced cytotoxicity in human keratinocytes,and L-NRF1s also serve as an important regulator of apoptosis, cell differentiation, tissue development, inflammation, maitaining DNA stability and proteasome homeostasis. To illustrate the mechanism of L-NRF1s activation by chronic arsenite exposure and the pretective roles of L-NRF1s against chronic arsenic exposure-induced skin hyperkeratosis and malignant transformation, human keratinocytes with selective deficiency and overexpressin of L-NRF1s by lentivirus are exposed continuously to low dose of arsenite with the concentrations according to human blood concentrations from Mangolia, then the morphological changes, DNA damage，cell cycle and apoptotic sensitivity will be investigated. In addition,the mRNA and protein level of potential NRF1-regulated genes, including cytokeratin, differentiation- related moleculars, inflammatory mediators and genes associated with encoding compartments of mitosis and proteasome, will be detected. We propose that long isoforms of NRF1 play protective roles against chronic arsenic exposure-induced skin hyperkeratosis and skin cancer. Our findings will provide an important reference for the prevention and treatment of chronic arsenic dermal toxicity.

慢性无机砷暴露可导致皮肤过度角化和皮肤癌，其机制尚不清楚。我们前期发现慢性砷暴露可诱导人类皮肤角质细胞株（HaCaT）发生恶性转化，氧化应激反应是其机制之一。长片段亚型NRF1(L-NRF1s) 是NRF1的亚型之一，介导细胞的抗氧化反应，在砷诱导的细胞毒性中起保护作用；而且NRF1还参与细胞凋亡与分化、组织发育、炎症反应、维持DNA稳定和蛋白酶体稳态等过程。本研究拟应用选择性沉默和过表达L-NRF1s的稳转HaCaT细胞，参照实际环境暴露人群的血砷浓度，在低剂量无机砷慢性暴露下，观察细胞的形态变化、DNA损伤情况、细胞周期和抗凋亡能力的变化，检测可能受NRF1调控的细胞角蛋白、分化相关分子、有丝分裂相关基因、蛋白酶体基因、炎症介质的表达，研究L-NRF1s的活化机制及对上述基因的调控作用，阐明其在慢性砷暴露致皮肤过度角化和皮肤癌中的保护作用及机制，为预防和治疗砷致皮肤损害提供思路和对策。

慢性无机砷暴露可导致皮肤过度角化和皮肤癌，其机制尚不清楚。氧化应激反应是慢性砷暴露导致人类皮肤角质细胞株（HaCaT）发生恶性转化的重要机制之一。我们前期的研究发现NRF2和长片段亚型NRF1(L-NRF1s)在急性砷暴露导致的HaCaTs细胞毒性和凋亡发挥保护性作用； NRF2的持续活化与慢性低剂量砷暴露致皮肤恶性转化密切相关。L-NRF1s不仅参与细胞的抗氧化反应，在砷诱导的细胞毒性中起保护作用；而且NRF1还参与细胞凋亡与分化、组织发育、炎症反应、维持DNA稳定和蛋白酶体稳态等过程。本研究通过建立NRF1各片段过表达稳转细胞模型，发现NRF1-447, NRF1-583和NRF1-742对急性砷暴露导致的细胞毒性和凋亡发挥保护性作用，而NRF1-584和NRF1-616过表达对砷导致的细胞毒性无明显差别。我们通过建立全亚型以及长片段亚型沉默的稳转HaCaT细胞，参照实际环境暴露人群的血砷浓度，以低剂量0.1 μM iAs3+和高剂量1μM iAs3+处理HaCaT细胞28周，发现慢性砷暴露导致细胞的恶性转化，0.1 μM低剂量暴露导致的肿瘤形成表现为高分化鳞癌，而1/2 μM高剂量砷暴露细胞表现为更好的终末分化和更高程度的角化。0.1 μM低剂量暴露更容易引起全亚型NRF1沉默（All-NRF1-KD）的细胞出现恶性转化，该过程与All-NRF1-KD细胞的获得性抗凋亡和细胞内NRF2的高表达密切有关；长片段亚型沉默（L-NRF1-KD）的细胞在慢性低剂量砷暴露后并未出现恶性转化，细胞内NRF2呈现低表达水平。尽管NRF1参与调控泛素蛋白酶体途径相关基因、有丝分裂部分基因和细胞角蛋白以及炎症因子的表达，可能在慢性砷暴露致HaCaTs细胞恶性转化过程中发挥重要作用，但慢性砷暴露导致细胞恶性转化过程是一个复杂的生物学过程。另外，低剂量的砷导致HaCaTs细胞内自噬过程的变化，可能参与细胞的恶性转化。本研究阐明了NRF1在慢性砷暴露致皮肤细胞恶性转化过程中的作用机制，为预防和治疗砷致皮肤损害提供了一定的思路。