CBR不同亚型在乙醇慢性心肌损害过程中的作用及分子机制研究

Alcohol abuse-associated pathology and relevant drug detection and evaluation have always been research focuses. Long-term alcohol abuse could cause myocardial injury, leading to alcoholic cardiomyopathy, or even sudden deaths. International scientists and our group have verified that the endocannabinoid system plays critical roles in myocardial injury, but the role of cannabinoid receptor (CBR) subtypes in alcohol-induced myocardial injury remains to be elucidated. In our previous work we found that after 30 days exposure to alcohol, the contents of major endocannabinoids changed inversely and the subcellular localization of CBR subtypes changed inconsistently, indicating the differential roles of CBR subtypes in alcohol-induced myocardial injury. Furthermore, iTRAQ-based proteomics revealed that alcohol-induced myocardial injury was related to cell apoptosis and oxidative stress signaling. Based on previous data, we would further establish the absolute quantitative method for both CBR subtypes using Nano-LC-MS/MS method, examine the content changes of CBR and endocannabinoids in alcohol-induced myocardial injury to determine the key CBR subtype that has the most significant alterations, and uncover the roles and mechanisms of key CBR subtype in alcohol-induced myocardial injury by using its selective antagonists/agonists and RNA interfering technique. Our project will provide additional evidence for clinical treatment and juridical evaluation in alcohol intoxication cases.

乙醇滥用致病机制及毒物学检测与评价一直备受关注。长期酗酒会引起心肌损害，导致酒精性心肌病，甚至引起猝死。国内外学者及我们研究证实内源性大麻素系统在心肌损害中具有重要作用，但大麻素受体（CBR）在乙醇致慢性心肌损害中的作用及机制有待明确。前期工作中我们发现乙醇作用30天后小鼠心肌主要内源性大麻素含量变化相反，CBR两种亚型细胞定位改变不一致，提示CBR不同亚型在乙醇慢性心肌损害中具有差异性作用。此外，iTRAQ蛋白质组学检测发现乙醇引起心肌损害主要涉及细胞凋亡、氧化应激等信号通路。基于此，我们将建立CBR两种亚型Nano-LC-MS/MS绝对定量方法，考察CBR亚型及配体在乙醇慢性心肌损害中的含量改变，明确改变显著的CBR亚型，并采用关键CBR亚型的选择性激动剂、拮抗剂及RNA干扰技术，揭示其在乙醇慢性心肌损害中的作用及下游信号机制。以上研究可为乙醇中毒相关临床诊疗和司法鉴定提供辅助依据。

长期大量饮酒会引起心肌损伤，甚至导致酒精性心肌病。基于前期研究已证实内源性大麻素系统在心肌损害中有重要作用，本课题重点围绕大麻素受体（CBR）在乙醇致慢性心肌损害中的作用及机制开展研究，主要包括以下三个方面： .首先，建立了慢性乙醇中毒致心肌损害体内外模型，通过组织形态学、血清学和心功能检测等手段，证实了慢性乙醇中毒心肌损害作用。建立了基于Nano-LC-MS/MS的CBR亚型检测方法，考察不同CBR亚型表达水平及不同配体含量在乙醇慢性心肌损害中的改变。结果发现，乙醇滥用显著增加了给药组小鼠心肌中AEA的含量，而2-AG含量降低；同时CB2R表达水平显著降低，而CB1R表达水平无差异。提示慢性乙醇中毒会导致心脏内源性大麻素系统失衡，不同亚型CBRs的生物学作用存在差异。.其次，研究了关键CBR亚型在乙醇慢性心肌损害中的生物学功能及下游分子信号机制。体内外实验证实乙醇慢性中毒可以激活心肌中RIP1/RIP3/MLKL介导的坏死性凋亡信号通路；利用不同亚型CBRs选择性激动剂或拮抗剂进行筛选研究，发现CB2R激动剂对坏死性凋亡有明显抑制作用，并进一步证实CB2R的药理性激活可以抑制乙醇引起的心肌细胞坏死性凋亡的发生，减轻心肌损害程度。.第三，基于高通量代谢和转录组学技术研究慢性乙醇中毒致心肌损害相关信号通路及关键因子。组学分析分别鉴定出166个差异表达代谢物、241个差异表达基因和19个差异表达microRNAs，乙醇滥用会影响小鼠心脏的氨基酸和能量代谢、核苷酸代谢，尤其是脂质代谢。针对组学分析发现的明显累积的毒性脂质神经酰胺，我们进一步开展机制研究。建立了9种神经酰胺LC-MS/MS检测方法，证实了乙醇可能通过从头合成途径促进神经酰胺的产生和积累，且神经酰胺在乙醇诱导的心脏毒性信号通路中起多种作用，包括溶酶体损伤和介导坏死性凋亡。.综上，本课题达到了预期的研究目标，阐释了CB2R在乙醇引起的心肌损伤中的重要作用及机制，并证实了抑制神经酰胺的产生可缓解乙醇引起的心肌损伤。研究结果可为乙醇中毒相关的心肌损害临床诊断及法医学鉴定提供辅助判断依据。