芽孢杆菌抗菌肽对海产品常见食源性致病菌的抑菌效应及其控制机制

以副溶血性弧菌为代表的常见致病菌对海产品污染严重，对于产量和出口量居全球首位的我国海产品行业来说，解决食源性致病菌的安全控制问题是当务之急。芽孢杆菌抗菌肽克服了传统的物理化学和Nisin抑菌方法的局限性，成为应用于食源性致病菌控制的必然趋势，但其抑菌效应及控制机制等关键问题亟待解决。本项目采用HPLC检测两种芽孢杆菌抗菌肽（前期获得）及surfactin浓度，通过其对五种常见海产品致病菌分离株的MIC/MBC的检测，来确定起主导作用的抑菌成分和抑菌效应，筛选目标抗菌肽；继而作用于两株代表性G-和G+菌分离株，在不同内外因素条件下，结合相关毒素免疫磁痕量检测技术，建立抗菌肽-致病菌及其毒素的数学模型，并通过测定致病菌细胞膜结构和通透性、代谢活力、蛋白质合成及其与DNA的相互作用，明确芽孢杆菌抗菌肽对致病菌的作用方式及控制机制，为芽孢杆菌抗菌肽用于海产品以及其它食品食源性致病菌控制奠定基础。

我国海产品行业常见致病菌污染严重，解决食源性致病菌安全控制问题当务之急。芽孢杆菌抗菌肽克服了传统的物理化学和Nisin抑菌方法的局限，成为应用于食源性致病菌控制的必然趋势，但其抑菌效应及控制机制等关键问题亟待解决。本课题优化并建立了定量检测抗菌脂肽surfactin的HPLC法。采用LC-MS分析抗菌肽APES-2和APNT-6的组分，比较两种抗菌肽对4种致病菌的MIC，发现APNT-6的控制能力强优于APES-2，其主要抗菌活性物质为surfactins。 APNT-6对多数水产品食源性病原菌和腐败菌具有较好的抑制作用。项目对副溶血性弧菌、金葡菌和单增李斯特氏菌的抑菌效应和模型进行了研究，结果表明抗菌肽对处于对数生长期副溶血性弧菌菌体比稳定期的作用敏感，杀灭作用与浓度和作用时间均相关，2MIC的抗菌肽作用96 h后菌体被杀灭。采用响应面法建立了副溶血性弧菌菌落总数对四项自变量（A:温度、B:盐度、C:pH、D:焦亚硫酸钠、E:抗菌肽浓度）的二次多项数学模型（Lg CFU/ ml=6.60+0.34A-0.23C-0.19E-0.29A2+0.19B2+ 0.3D2-0.35AB）。模型（拟合程度R2为0.8963）可用于描述不同因素条件下对虾中副溶血性弧菌的控制规律。研究了对金葡菌生长和产毒的控制规律， APNT-6在1MIC可抑制菌体24小时，3MIC可抑制毒素的增加， 4MIC时才可将金葡菌杀灭，对菌体生长控制符合Logistic模型；产毒控制模型是：3MIC APNT-6符合Richards模型；2MIC、1MIC、0.5MIC的 APNT-6的控制符合Logistic模型；0.25MIC的APNT-6符合Gompertz模型。所建模型（拟合度R2值均大于0.9）能够较好地描述抗菌肽对金葡菌及其产毒的控制规律。APNT-6能够导致菌体细胞膜通透性改变，细胞膜产生孔洞，内容物泄漏；能够抑制部分蛋白质合成，还可影响DNA功能以及细胞的代谢活力。抗菌肽对阳性菌作用大，阴性菌作用小。此外，APNT-6对金葡菌和单增李斯特氏菌及腐败菌生物被膜的形成具有很好的控制和清除作用。APNT-6口服半数致死剂量（LD50）大于5000mg/kg小鼠体重，急性毒性评级属实际口服无毒级。项目研究成果为芽孢杆菌抗菌肽用于海产品食源性致病菌及腐败菌的控制奠定了理论基础。